Summary
La ultracentrifugación analítica (AUC) de células de la muestra tiene la muestra y el tampón de referencia y durante los experimentos y se expone a alto vacío y la velocidad del rotor de hasta 60.000 rpm. Este vídeo demuestra la rigurosa atención a los detalles necesarios para la concentración, la carga y la alineación de este componente muy importante de un experimento AUC.
Abstract
La ultracentrifugación analítica (AUC) es una poderosa herramienta biofísicos que nos permite grabar perfiles macromoleculares de sedimentación durante el centrifugado de alta velocidad. Cuando está bien planificada y ejecutada, una velocidad de sedimentación AUC o el experimento de equilibrio de sedimentación puede revelar mucho acerca de una proteína en cuanto a tamaño y forma, pureza de la muestra, el coeficiente de sedimentación, los estados de oligomerización y las interacciones proteína-proteína.
Esta técnica, sin embargo, requiere un nivel riguroso de atención técnica. Las células de la muestra tienen un pedazo de centro sectorizado intercalada entre dos conjuntos de la ventana. Ellos son sellados con una presión de par de aproximadamente 120 a 140 in / lbs. Buffer y muestra se cargan en los sectores central y luego de sellado, las células están perfectamente alineados en un rotor de titanio, para que los sistemas de detección de lectura óptica tanto de la muestra y el tampón de referencia en la línea media trayectoria radial misma a través de cada sector central, mientras que giran a velocidades de hasta 60, 000 rpm y bajo vacío muy alto
No sólo es el montaje adecuado de células de la muestra crítico, componentes de la muestra de células son muy caros y deben ser debidamente atendidos para asegurar que están en óptimas condiciones de trabajo a fin de evitar fugas y roturas durante los experimentos. Manejar con cuidado las ventanas, por la más mínima grieta o rasguño puede conducir a la rotura en la centrífuga. El contacto entre el centro y ventanas deben ser lo más ajustado posible, es decir, sin los anillos de Newton s debe ser visible después de la presión se aplica el par. Polvo, pelusas, los arañazos y los aceites ya sea en el centro de la ventana o todo compromiso y este contacto puede conducir fácilmente a la filtración de soluciones de un sector a otro o se escape de la central todos juntos. No sólo son muestras valioso que se perdió, la filtración de soluciones durante un experimento se producirá un desequilibrio de presión en la celda que a menudo conduce a la rotura de cristales y centros de mesa. Además, las juntas de enchufe y clavijas de vivienda debe estar en su lugar para evitar soluciones que se retiró del sector central a través de los orificios de carga por el alto vacío en la cámara de centrifugado. Revestimientos de las ventanas y las juntas deben estar libres de roturas y grietas que podrían causar el movimiento resultante de las ventanas rotas.
Este vídeo demuestra nuestros procedimientos de montaje de la muestra de células, el par, la carga y la alineación del rotor para ayudar a minimizar el daño a los componentes, la solución de fugas y roturas durante el experimento perfecto AUC.
Protocol
Muestra la Asamblea Celular y Torque
- Comenzamos la construcción de la muestra de células uniendo dos montajes de ventana.
Coloque una junta de ventana en el soporte de la ventana. Coloque el revestimiento de la ventana (o es algunas veces llamado un amortiguador de la ventana) en el interior del soporte de ventana para que la abertura de la camisa se encuentra frente a la ranura del soporte. Con una ligera inclinación, coloque la ventana en el soporte de la alineación de la marca escriba en la ventana con la forma en clave del titular de la ventana. Presione con suavidad en los bordes muy a ambos lados de la ventana. - Para garantizar el cierre y el par exacto de la celda de muestra, cubrir ligeramente la junta de la vivienda y la rosca con un lubricante Spinkote. Extender una pequeña cantidad de Spinkote entre el pulgar y el índice. Cubra las roscas rosca con una fina capa invisible de Spinkote. Del mismo modo, cubra la junta de la vivienda. Limpie cualquier lubricante visible.
- Iniciación de Montaje de la muestra de células de un montaje de ventanas corredizas, con la ventana que daba hacia usted, en la caja del celular mediante la alineación de la ranura de la llave de la vivienda. Alinear la ranura central con la llave de la vivienda y se deja caer suavemente en la parte superior del montaje de ventanas dentro de la célula.
- Nunca utilice ningún tipo de herramienta para empujar la pieza central en la caja del celular. Esto podría causar daños permanentes en el CP que resulta en pérdida durante los experimentos. Gire el conjunto segunda ventana para que la ventana esté mirando hacia el centro, lejos de ti, alinear chavetero con llave de vivienda y deslice hacia abajo en la parte superior de la central. Coloque una junta de vivienda en la parte superior, entonces, una tuerca por lo que la palabra "Out" es visible. Con los dedos y una herramienta de alineación, apriete la rosca.
Si el CP no se desliza fácilmente en el barril de la vivienda, la primera alineación, entonces, colocar el conjunto de segunda ventana en la parte superior de la misma. Al aplicar presión a la baja suave en el montaje de ventanas, deslice ambos en la caja del celular al mismo tiempo. De esta manera, evitar presionar directamente en el PC.
Ahora es un buen momento para mirar dentro de la célula de polvo, pelusas y las huellas dactilares. También se dará cuenta de los Anillos de Newton que indican que aún queda aire entre el PP y las ventanas. Estas desaparecerán después de la aplicación de torque. - Con la rosca y la palabra "fuera" visible, coloque la celda muestra todo el camino hasta el interior de la pinza par de células de la pie de torque. Mantenga la célula en su lugar mediante la aplicación de una presión constante sobre el mango de pie de torque. En un movimiento continuo, apriete la rosca de entre 120 a 140 en-libras. Si se utiliza una llave de torsión ajustable micrómetro, se establece en entre 120 a 140 in / lbs y apriete la rosca hasta que la llave haga "clic" que indica el par de giro se ha alcanzado. Suelte la palanca de pie de par y retire con cuidado la celda de la muestra sin tocar las ventanas.
De carga y sellado de la celda de la muestra
- Para los experimentos de velocidad de sedimentación, de manera rutinaria cargar un volumen de 400ul en cada sector de la piedra angular de 12mm con una pipeta 200ul. La posición de la celda de muestra con los orificios de carga en la parte superior y la palabra "out" en la rosca visible. Deslice la punta de la pipeta hasta la mitad en el sector central de la izquierda a través de los orificios de carga y poco a poco prescindir de 200ul de solución de referencia. Repetir una vez a un total de 400ul. Utilizando la punta de la pipeta mismo y la misma técnica, con cuidado y lentamente llenar el sector central de la derecha con 400ul de solución de la muestra.
Volúmenes de 150 a 180 ul se utilizan para los experimentos de equilibrio de sedimentación, pero el mismo cuidado y la técnica se debe seguir.
Es imprescindible para que coincida con los volúmenes de las soluciones de referencia y la muestra lo más cerca posible. Colocación de la punta de la pipeta con firmeza en la pipeta, poco a poco la carga y distribución de soluciones, evitando las burbujas de carga y el uso de la misma punta de la pipeta para ambas soluciones a todos ayudar a mantener el volumen lo más equitativa posible. - Sello de la célula mediante la colocación de dos nuevas juntas de clavija de la vivienda perfectamente en cada agujero de carga asegurándose de que están situados entre la pieza central y la carcasa de aluminio. Cubra cada uno con un enchufe de la vivienda. Apriete a mano con un destornillador plano pequeño.
Alineación de la celda de la muestra en el rotor
- Antes de cargar el rotor, asegúrese de que el contrapeso no es más que 0,5 g más ligera que la célula de muestra en la posición opuesta en el caso de que las filtraciones de la celda de muestra. Comience con el saldo en cero. Primer pesaje de la célula de la muestra que estará en posición opuesta al CB. Tarar la balanza para restar peso de la célula de la muestra, entonces, pese la CB. Sumar o restar el peso del orificio de fijación del contrapeso. Asegúrese de que los pesos no sobresalen de la parte superior. Pesar de nuevo para asegurarse de que el contrapeso final está dentro de 0,5 g más ligera que la célula de muestra lo contrario.
- El uso de un rotor de 4 posiciones, coloque el contrapeso en la posición 4, de manera que la flecha blanca es visible y apuntando en tque la dirección de la fuerza centrífuga. Asegúrese de que está todo el camino hasta el interior del rotor. Suavemente apriete el tornillo de fijación, que se encuentra en la parte superior del contrapeso justo al otro lado de la flecha blanca, hasta que el contrapeso es firme en su lugar, pero aún capaz de ser alineados. La posición de la celda de muestra equilibrada con los tapones de vivienda que enfrenta el centro del rotor y la palabra "out" en la rosca visible.
- Mirando desde debajo del rotor, alinear la marca de escribano en el interior (la marca más cercana al centro del rotor) con la marca de escribano en el contrapeso mediante una herramienta de alineación. Apriete el tornillo de fijación para bloquear contrarrestar alineados en su lugar. De la misma manera, alinear la celda de la muestra marca escribano con la marca escriba en el interior en la posición 2 en el rotor.
Para más información, consulte https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx
Discussion
El montaje adecuado de las células, la inserción de la muestra, y la alineación de celdas en el rotor es fundamental para la alta calidad de los experimentos AUC. Esto es cierto, en particular, para los experimentos que requieren un análisis muy detallado de los datos obtenidos en los perfiles de sedimentación macromoleculares, por ejemplo, al estudiar las interacciones de proteínas y la determinación de trazas agregado. A menudo, la calidad del montaje del experimento se limita a la exactitud y la precisión de los resultados del estudio de las AUC. Para más detalles sobre el diseño y la ejecución práctica de experimentos AUC, ver Referencias 1 - 3. Talleres sobre la configuración de práctica, teoría y análisis de los datos de los experimentos de las AUC están llevando a cabo dos veces al año en nuestro laboratorio en los Institutos Nacionales de Salud [4].
Acknowledgments
Reconocemos el apoyo a la investigación por el Programa de Investigación Intramural del NIBIB, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-place Ti analytical rotor | Beckman Coulter Inc. | 361964 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter Inc. | 361318 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter Inc. | 362340 | |
| Spinkote Lubricant | Beckman Coulter Inc. | 306812 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter Inc. | 360219 | |
| Cell Housing kit | Beckman Coulter Inc. | 334602 | |
| Window gasket | Beckman Coulter Inc. | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter Inc. | 362329 | |
| Window, sapphire | Beckman Coulter Inc. | 307177 | |
| Window, quartz | Beckman Coulter Inc. | 301730 | |
| Window holder | Beckman Coulter Inc. | 305037 | |
| 12mm double sector Epon centerpiece | Beckman Coulter Inc. | 306493 | |
| Cell plug gaskets | Beckman Coulter Inc. | 327022 | |
| Cell housing plug | Beckman Coulter Inc. | 362327 |
References
- Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).
- Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).
- analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit [Internet]. , Peter Schuck. Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm Forthcoming.
- Home - Workshops [Internet]. , National Institutes of Health. Available from: https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx Forthcoming.
