Summary
Den analytiska ultracentrifugen (AUC) prov cell innehåller prov och referens buffert och under experiment och utsätts för högt vakuum och rotor hastigheter upp till 60.000 rpm. Denna video kommer att visa de rigorösa uppmärksamhet på detaljer som behövs för montering, lastning och anpassningen av denna mycket viktiga del av en AUC-experiment.
Abstract
Den analytiska ultracentrifugen (AUC) är ett kraftfullt biofysiska verktyg som tillåter oss att spela in profiler makromolekylära sedimentering under hög hastighet centrifugering. När väl planerade och genomförda, kan en AUC sedimentering hastighet eller sedimentering jämvikt experiment avslöjar mycket om ett protein i fråga om att storlek och form, prov renhet, sedimentering koefficient, oligomerisering stater och protein-protein interaktioner.
Denna teknik kräver dock en noggrann nivå av teknisk uppmärksamhet. Provkuvetterna hålla en sectored blickfång inklämt mellan två fönster församlingar. De är förseglade med ett vridmoment tryck på cirka 120-140 i / lbs. Referens buffert och prov laddas in i mittpunkten sektorer och sedan efter försegling, de celler exakt anpassat till en titan rotorn så att den optiska system för upptäckt skanna både prov och referens buffert i samma radiella väg mittlinjen genom varje mittpunkten sektorn samtidigt som roterar med hastigheter på upp till 60, 000 rpm och under mycket högt vakuum
Inte bara är riktigt prov cell montering kritisk, prov cellens komponenter är mycket dyra och måste vara korrekt vårdas för att säkerställa att de är i optimalt skick för att undvika läckage och brott under experiment. Hantera fönster noggrant, även för de minsta spricka eller repa kan leda till brott i centrifugen. Kontakten mellan mittpunkten och fönster skall vara så strama som möjligt, dvs ingen Newtons ringar ska vara synlig efter vridmoment trycket tillämpas. Damm, ludd, repor och oljor på antingen Windows eller höjdpunkten alla kompromisser denna kontakt och kan mycket lätt leda till läckage av lösningar från en sektor till en annan eller läcker ut från mittpunkten alla tillsammans. Inte bara är dyrbara prover förlorade, läckande av lösningar under ett experiment kommer att orsaka en obalans av trycket i cellen som ofta leder till krossade fönster och centerpieces. Dessutom måste ansluta packningar och pluggar bostäder vara säkert för att undvika lösningar som drog sig ur mittpunkten sektorn genom lastning hålen av de höga vakuum i centrifugen kammaren. Fönster liners och packningar skall vara fria från brott och sprickor som kan orsaka som resulterar i trasiga fönster.
Denna video kommer att visa våra rutiner prov cell montering, vridmoment, lastning och rotor anpassning för att minimera skador på komponenter, lösning läcker och brott under den perfekta AUC experimentet.
Protocol
Sample Cell Montering och Vridmoment
- Vi börjar byggandet prov cellen genom att sätta samman två fönster församlingar.
Placera ett fönster packning i fönstret hållaren. Placera fönstret liner (eller det som ibland kallas ett fönster kudde) innanför fönstret hållaren så att öppnandet av liner är mittemot kilspår av innehavaren. Vid en liten vinkel, placera fönstret i hållaren anpassa skrivaren märket på fönstret med viktigt sätt i fönstret hållaren. Tryck försiktigt på mycket kanterna på båda sidor av fönstret. - För att säkerställa korrekt försegling och korrekt moment av provet cellen, vi lätt päls huset packningen och skruven ringen med Spinkote smörjmedel. Sprid en mycket liten mängd Spinkote mellan tummen och pekfingret. Stryk på tätningsmassa skruven ringen med en tunn, osynlig hinna av Spinkote. Likaså päls huset packningen. Torka bort synlig smörjmedel.
- Börja monteringen prov cellen genom att skjuta ett fönster montering, med fönstret uppåt mot dig, in i cellen huset genom att rikta in kilspår med huset nyckeln. Justera mittpunkten kilspår med bostäder nyckeln och låt det försiktigt falla på toppen av fönstret monteringen inne i cellen.
- Använd aldrig någon form av verktyg för att driva navet i cellen bostäder. Detta kan orsaka permanent skada på KP ger läcka under experiment. Slå det andra fönstret monteringen så att fönstret är vänd mot mittpunkten, bort från dig, anpassa kilspår med bostäder nyckel och skjut ner det på toppen av mittpunkten. Placera ett hölje packning ovanpå, då en skruv ringen så ordet "Out" är synlig. Använd dina fingrar och en anpassning verktyg, dra åt skruven ringen.
Om CP inte glider lätt in i huset fat, först rikta in det då, placera det andra fönstret montering ovanpå det. Genom ett lätt tryck nedåt på fönstret montering, skjut både i cellen bostäder på samma gång. På detta sätt undviker vi att trycka direkt på CP.
Nu är det dags att titta in i cellen för damm, ludd och fingeravtryck. Du kommer också att märka Newtons ringar som indikerar det fortfarande finns luft mellan KP och fönstren. Dessa försvinner efter att tillämpa vridmoment. - Med skruven ringa upp och ordet "out" synliga, placera provet cellen hela vägen ner inuti cellen vridmoment hylsan av vridmomentet monter. Håll cell på plats genom att konstant tryck på vridmomentet står handtaget. I en kontinuerlig rörelse, dra åt skruven ringen till mellan 120-140 in-lbs. Om du använder en skiftnyckel mikrometer vridmoment, ställ in den på mellan 120-140 i / kg och dra åt skruven ringen tills skiftnyckel "klick" som visar det inställda momentet har uppnåtts. Släpp handtaget vridmoment stå och dra försiktigt bort provet cellen utan att röra vid fönstren.
Lastning och Tätning Sample Cell
- För experiment sedimentering hastighet, last vi rutinmässigt en mängd 400ul i varje sektor av 12mm mittpunkten med hjälp av en 200ul pipett. Placera provet cellen med lastning hålen på topp och ordet "out" på skruven ringen synlig. Skjut pipetten sätt spetsen halv ner i vänster mittpunkten sektorn genom lastning hål och sakta avstå 200ul hänvisning lösning. Upprepa en gång till total 400ul. Med samma pipettspetsen och samma teknik, försiktigt och långsamt fyller RÄTT mittpunkten sektorn med 400ul av provlösningen.
Volymerna av 150-180 ul används för experiment sedimentering jämvikt men samma omsorg och teknik bör följas.
Det är absolut nödvändigt för att matcha volymer av referens-och prov-lösningar så nära som möjligt. Montering pipettspetsen fast på pipetten, långsamt lastning och utlämning lösningar, att undvika lastning bubblor och med samma pipettspetsen för båda lösningarna alla stöd i att hålla volymerna så lika som möjligt. - Täta cellen genom att placera två nya röda packningar bostäder kontakten perfekt i varje lastning hål se till att de är placerade mellan centrum pjäs och aluminium bostäder. Täck varje med ett hölje plugg. Dra åt med en liten platt skruvmejsel.
Exempel Celljustering i Rotor
- Innan du laddar rotorn, se till motvikt är inte mer än 0,5 g lättare än provet cellen i motsatt position i fall att provet cellen läckor. Börja med balansen på noll. Först väger provet cell som skall vara i läge mittemot CB. Tare balansen för att subtrahera vikten prov cellen då väga CB. Lägg till eller ta bort vikt från fästhål av motvikt. Se till att vikterna inte sticker ut från toppen. Väg att säkerställa att den motvikt slutliga vikt är inom 0,5 g lättare än det motsatta prov cellen.
- Med hjälp av en 4-plats rotor, placera en motvikt i position 4, så att den vita pilen syns och pekar på than riktning centrifugalkraft. Se till att det är hela vägen inne i rotorn. Försiktigt skruva ställskruven, som finns på toppen av motvikt mittemot den vita pilen, tills motvikt sitter stadigt på plats, men ändå kunna anpassas. Placera balanserade prov cellen med bostäder pluggar mot centrum av rotorn och ordet "out" på skruven ringen synlig.
- Söker underifrån rotorn, rikta insidan skriftlärde märket (märket närmast centrum av rotorn) med skrivaren märket på motvikt med en justering verktyg. Dra åt ställskruven för att låsa linje motvikt på plats. På samma sätt, anpassa provet markera cellen skrivare med insidan skrivare märket på position 2 på rotorn.
För mer information se https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx
Discussion
Korrekt cellen montering, prov in, och celljustering i rotorn är avgörande för hög kvalitet AUC experiment. Detta gäller i synnerhet för experiment som kräver en mycket detaljerad analys av de förvärvade uppgifter om profilerna makromolekylära sedimentering, till exempel när man studerar proteininteraktioner och bestämma spårmängder aggregat. Ofta kvaliteten på experimentuppställning är begränsande för den noggrannhet och precision av resultaten från AUC studien. Mer information om den praktiska utformningen och vidare genomförande av AUC experiment, se Referenser 1 - 3. Verkstäder som täcker praktiskt setup, teori och analys av data från AUC experiment hålls två gånger per år i vårt laboratorium vid National Institutes of Health [4].
Acknowledgments
Vi erkänner den forskning stöd från Interna forskningsprogram NIBIB, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-place Ti analytical rotor | Beckman Coulter Inc. | 361964 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter Inc. | 361318 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter Inc. | 362340 | |
| Spinkote Lubricant | Beckman Coulter Inc. | 306812 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter Inc. | 360219 | |
| Cell Housing kit | Beckman Coulter Inc. | 334602 | |
| Window gasket | Beckman Coulter Inc. | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter Inc. | 362329 | |
| Window, sapphire | Beckman Coulter Inc. | 307177 | |
| Window, quartz | Beckman Coulter Inc. | 301730 | |
| Window holder | Beckman Coulter Inc. | 305037 | |
| 12mm double sector Epon centerpiece | Beckman Coulter Inc. | 306493 | |
| Cell plug gaskets | Beckman Coulter Inc. | 327022 | |
| Cell housing plug | Beckman Coulter Inc. | 362327 |
References
- Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).
- Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).
- analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit [Internet]. , Peter Schuck. Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm Forthcoming.
- Home - Workshops [Internet]. , National Institutes of Health. Available from: https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx Forthcoming.
