Immunology and Infection

Rening av specifik cell Befolkningen efter Fluorescens Aktivt cellsortering (FACS)

Published: July 10, 2010 doi: 10.3791/1546

Sreemanti Basu¹, Hope M. Campbell¹, Bonnie N. Dittel¹, Avijit Ray¹

¹Blood Research Institute, BloodCenter of Wisconsin

Summary

För många vetenskapliga studier som kräver en biologisk och kemisk analys av cellpopulationer cellerna måste vara i en hög tillstånd av renhet. Fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) är en överlägsen metod där för att få rena cellpopulationer.

Abstract

Experimentella och kliniska studier kräver ofta mycket rent cellpopulationer. FACS är en teknik val för att rena cellpopulationer av kända fenotyp. Andra delen metoder för rening inkluderar panorering, kompletterar utarmning och magnetiska pärla separation. Dock har FACS flera fördelar jämfört med andra tillgängliga metoder. FACS är den bästa metoden när mycket hög renhet av önskad befolkningen krävs, när målcellpopulationen uttrycker en mycket låg nivå identifiera markör eller när cellpopulationer kräver separation baserad på differentiell markör densitet. Dessutom är FACS den enda tillgängliga reningsteknik att isolera celler baserat på interna färgning eller intracellulärt protein uttryck, såsom en genetiskt modifierad fluorescerande protein markör. FACS medger rening av enskilda celler baserat på storlek, granularitet och fluorescens. För att rena celler av intresse, är de först färgats med fluorescerande-märkta monoklonala antikroppar (mAb), som erkänner specifik yta markörer på önskad cellpopulation (1). Negativt urval av ofärgade celler är också möjligt. FACS rening kräver en flödescytometer med sortering kapacitet och lämplig mjukvara. För FACS, celler i suspension skickas som en ström i små droppar med var och en innehåller en enda cell framför en laser. Fluorescensen upptäckt systemet upptäcker celler av intresse grundar sig på förutbestämda fluorescerande parametrar av cellerna. Instrumentet tillämpar en avgift för att droppen som innehåller en cell av intresse och en elektrostatisk nedböjning Systemet underlättar insamling av laddade droppar in lämpliga insamlingssystem rör (2). Framgången för färgning och därmed sortering stor del beror på valet av att identifiera markörer och valet av MAB. Sortering parametrar kan justeras beroende på kravet på renhet och avkastning. Även FACS kräver specialiserad utrustning och utbildning av personal, är det viktigaste metoden för isolering av renade cellpopulationer.

Protocol

Innan processen startar, följande punkter måste vara att samlas in och bearbetade:
1. Ice
2. 15 ml koniska rör för färgning celler och 12 x 75 mm rör flöde för färgning enda färg kontroller.
3. Färgning buffert: fosfatbuffrad saltlösning (PBS) + 3% fetalt kalvserum (FCS)
4. Pipetter
5. Fc block (om det behövs) och antikroppar färgning. Antikroppar måste titreras för optimal färgning.
6. Ersättning pärlor
7. Fjädring buffert: Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS
8. Trypan blått och hemocytometer
9. Cell sil (40 ìm Nylon)
10. Insamling rör: Två typer av kollektionen rör kan användas a) 12 x 75 mm polystyren rör (som innehåller 300 l FCS och 25 mM HEPES) eller b) 15 ml koniska rör (innehållande 1 ml FCS + 25 mm HEPES). Varje rika medium med hög serumkoncentration kan användas för uppsamling av sorterade celler.
Generera en enda cell uppskov med start cellpopulation.
Tillval: Berika för önskad cellpopulation med en bulk reningsmetod som komplement utarmning eller magnetisk sortering. Den största fördelen med anrikning steget är att det minskar sortera tid.
Tvätta cellerna gång med färgning buffert.
Kassera supernatanten och suspendera cellerna i färgning buffert vid en koncentration på upp till 50 x 10 ⁶ för effektiv färgning.
Tillval: För celler som uttrycker höga nivåer av FCR, blockera receptorerna med lämplig blockering metod. En metod som föredras är att använda en mAb som binder till FcγR på is i 10-15 min. Dessa antikroppar finns kommersiellt tillgängliga.
Tillsätt lämplig Mab (vid en bestämd koncentration) att färga den önskade cellen befolkningen och inkubera i 20-30 min på is i mörkret, följt av två tvättar med färgning buffert. Tillval: färgning med en viktig färg, som propidiumjodid, kan ingå att urskilja döda celler (5). Om flera färger färgning ska användas, är enda färg kontroller som krävs. Vi använder BD CompBeads att förbereda enda färg kontroller enligt tillverkarens protokollet.
Om du inte använder direkt konjugerade antikroppar, upprepa steg 7 med hjälp av lämpliga sekundär antikropp eller Streptavidin konjugat.
Efter tvättning, resuspendera cellerna i odlingsmedium och bestämma cellkoncentrationen med hjälp av en viktig färgämne som Trypan blå.
Justera cellkoncentrationen till 15-20 x 10 ⁶ / ml. För cellpopulationer som bildar kluster som kan täppa instrumentet under sortering, filtrera celler genom en sil.
Ställ in och optimera cellen sorterare. Processen med att inrätta en flödescytometer varieras beroende på tillverkning och måste utföras av utbildad personal.
De allmänna rekommendationerna är följande:
1. Välj rätt munstycke beroende på vilken celltyp som ska sorteras.
2. För sterila sorterar, sterilisera instrumentet.
3. Utför styrinstrument kvalitet med pärlor för att verifiera lasrar fungerar, och det är sortering korrekt.
4. Installera önskade samlingen enheten och ställa in sidan strömmar.
5. Titta på instrumentets laser och detektor inrättats för att bestämma den fluorescerande etiketter som kan användas (vår BD FACS Aria har tre lasrar och kan upptäcka upp till nio färger).
6. När det avgörs vad fluorescerande etiketter kommer att användas på cellen sorterare, kan ersättning utföras (som förklaras nedan).
Utför ersättningen med negativt kontrollprov och den enda positiva kontroller. Ersättningen är nödvändigt att ta bort det spektrum överlappningen mellan två detektorer. Det är relevant att påpeka att ersättning inte är idiotsäker och påverkas negativt av hur starkt vissa markörer fläcken, och genom fluorescens av celler som har låga autofluorescens vilket kan leda till dålig upplösning mellan svagt och negativa populationer.
För bästa resultat bör experimentell design inkluderar användning av ljusa fluorokromer med markörer som har låga uttryck eller som inte har en känd färgningsmönster. Markörer som ger god separation mellan cellpopulationer och är mycket uttryck bör användas med dimer fluorokromer som de upphetsade av röd eller violett laser.
1. Ersättning kan utföras med kompensation pärlor, som är polystyren mikropartiklar som har kopplat till en antikropp som är specifik för Kappa lätta kedjan av Ig från mus, råtta eller råtta / hamster. Pärlorna är lätta att färga, har en robust signal och ett enkelt sätt att förbereda enda färgade kontroller som har samma fluoroforen som den experimentella prover.
2. Inrätta en mall som innehåller en bivariat komplott för att visa Forward Scatter (FSC) och Side Scatter (SSC), och ett histogram förvarje fluorokrom som kommer att användas.
3. Kör den negativa kontrollen röret och justera Forward Scatter (FSC) och Side Scatter (SSC) för att placera befolkningen i ränta på skalan.
4. Justera fluorescens PMT-inställningarna för att placera den negativa befolkningen eller autofluorescens längst vänstra delen av histogrammet.
5. Spela in den negativa kontrollen röret.
6. Kör enda positiva kontroll rör och registrera data för varje rör.
7. Rita ett intervall grind runt den positiva delen av data på histogram och annan intervall grinden på den negativa delen av histogrammet.
8. Manuell kompensation sker genom att justera median (median är en bättre uppskattning av centrala tendenser än den genomsnittliga på en logaritmisk skala) av de positiva tills det är lika med medianen av de negativa. Detta måste göras för varje fluorokrom etiketter som används i experimentet.
9. För att justera medianen, justera spektral överlappning värden antingen högre eller lägre tills medianerna för varje fluorescerande parameter match så nära som möjligt.
10. Ersättning kan också göras automatiskt med analysprogram. Automatisk kompensation använder de registrerade uppgifterna från ersättning kontroller för att beräkna ett algebraiskt matris för alla fluoroforer som används i experimentet. Dessa värden används för att dra ut bidragen från det icke-primära färger som blöder in i en primär färg är detektor.
Spela in den experimentella prov som ska sorteras och använda gating verktyg och delmängder av metoder för att definiera populationer av intresse.
1. Ställ in den experimentella mallen med en punkt plot som visar FSC-mot SSC och använda en slussning verktyg, polygon, rektangel, intervall eller kvadranten till gate befolkning av intresse. Den spridningsdiagram visar de fysiska egenskaperna hos den cell som skiljer den celltyp.
2. Det bästa sättet att bestämma fluorescens gating strategi är att använda fluorescens minus ett (FMO) kontroller. I en FMO kontrollrör alla reagenser som används i experimentet ingår förutom ett av intresse. Den FMO hjälper diskriminerar mellan svagt färgade populationer och bred negativa populationer.
3. Använd de uppgifter som registrerats från FMO rör att avgöra var att sätta grindar inom experimentell röret.
När portarna har fastställts, kan portarna väljas för sortering i externa samling rör. Upp till fyra portar (eller populationer) kan sorteras på en gång beroende på instrumenteringen finns.
Kör experimentella provröret vid 4 ° C, slå på nedböjning tallrikar, och sortera provet. 5 x 10 ⁵ -1,5 x 10 ⁶ celler kan sorteras in i en 12 x 75 mm rör och 1,5 x 10 ⁶ - 4,5 x 10 ⁶ celler kan sorteras in i en 15 ml konisk.
När rätt antal celler har erhållits, manuellt stoppa sortering.
Gör en post-sorts analys för att fastställa renheten hos den sorterade cellpopulationer.

Representativa resultat

Vi har visat här resultaten för mus mjälten B och CD4 T-cell sortering (Figur 1). Splenocytes färgades med PE Texas Red-konjugerat anti-mus B220, FITC-konjugerat anti-mus TCRβ och Alexafluor-700-konjugerat anti-mus CD4 att identifiera B-celler (B220 + TCRβ-) och CD4 T-celler (CD4 + TCRβ + ). Sorteringen utfördes med BD FACS Aria instrument. Efter sortering av B-celler renhet var> 97% och CD4 T celler renhet var> 98%.

Figur 1
Figur 1. Renhet av mjälten B-celler och CD4 T-celler efter FACS. Pigg splenocytes färgades med anti-mus-B220, TCRβ och CD4 antikroppar. FACS för B-celler genomfördes med en BD FACS Aria genom gating på B220 + TCRβ-celler (Fig. 1A, till vänster, nedre högra kvadranten). En post sorts analys utfördes för att fastställa renheten hos B-celler (Fig. 1A, högra panelen). B220 färgning visas på x-axeln och TCRβ färgning på y-axeln. FACS för CD4 T-celler utfördes med samma flödescytometer av gating på TCRβ + CD4 + celler (Fig. 1B, vänstra panelen övre högra kvadranten). En post sorts analys utfördes för att bestämma renhet CD4 T-celler (Fig. 1B, högra panelen). TCRβ färgning visas på x-axeln och CD4 färgning på y-axeln. Andelen positiva celler i varje kvadrant visas.