Immunology and Infection

विशिष्ट सेल जनसंख्या के प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी (FACS) के द्वारा शुद्धीकरण

Published: July 10, 2010 doi: 10.3791/1546

Sreemanti Basu¹, Hope M. Campbell¹, Bonnie N. Dittel¹, Avijit Ray¹

¹Blood Research Institute, BloodCenter of Wisconsin

Summary

कई वैज्ञानिक अध्ययन के लिए सेल आबादी का एक जैविक और रासायनिक विश्लेषण की आवश्यकता कोशिकाओं शुद्धता की एक उच्च राज्य में होना चाहिए. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) जिसमें शुद्ध सेल आबादियों को प्राप्त करने के लिए एक बेहतर तरीका है.

Abstract

प्रायोगिक और नैदानिक अध्ययन अक्सर अत्यधिक सेल आबादी शुद्ध की आवश्यकता होती है. FACS पसंद की एक तकनीक के लिए जाना जाता phenotype के सेल आबादी को शुद्ध है. शुद्धि के अन्य थोक तरीकों panning, पूरक रिक्तीकरण और चुंबकीय मनका जुदाई शामिल हैं. हालांकि, FACS अन्य उपलब्ध तरीकों पर कई फायदे हैं. FACS पसंदीदा तरीका है जब वांछित जनसंख्या का बहुत ही उच्च शुद्धता की आवश्यकता होती है, जब लक्ष्य सेल की आबादी पहचान मार्कर के एक बहुत कम स्तर व्यक्त या जब सेल आबादी जुदाई अंतर मार्कर के घनत्व के आधार पर की आवश्यकता होती है. इसके अलावा, FACS ही उपलब्ध शुद्धि आंतरिक धुंधला हो जाना या intracellular प्रोटीन अभिव्यक्ति पर आधारित एक आनुवंशिक रूप से संशोधित फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर के रूप में ऐसी कोशिकाओं को अलग तकनीक है. FACS की अनुमति देता है अलग - अलग आकार granularity, और प्रतिदीप्ति के आधार पर कोशिकाओं की शुद्धि. आदेश में ब्याज की कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए, वे पहले fluorescently टैग मोनोक्लोनल (एमएबी) एंटीबॉडी, जो वांछित सेल की आबादी (1) पर विशिष्ट सतह मार्करों की पहचान के साथ दाग रहे हैं. बेदाग कोशिकाओं के नकारात्मक चयन भी संभव है. FACS शुद्धि छँटाई क्षमता और उचित सॉफ्टवेयर के साथ एक प्रवाह cytometer की आवश्यकता है. FACS के लिए, निलंबन में कोशिकाओं प्रत्येक के साथ एक लेज़र के सामने में एक एकल कोशिका युक्त बूंदों में एक धारा के रूप में पारित कर रहे हैं. प्रतिदीप्ति पहचान प्रणाली कक्षों की पूर्व निर्धारित फ्लोरोसेंट मापदंडों के आधार पर ब्याज की कोशिकाओं का पता लगाता है. साधन ब्याज की एक सेल और एक electrostatic विक्षेपन प्रणाली उपयुक्त संग्रह ट्यूब (2) में चार्ज बूंदों के संग्रह की सुविधा युक्त छोटी बूंद के लिए एक प्रभारी लागू होता है. धुंधला की सफलता और जिससे छँटाई पहचान मार्करों और MAB की पसंद के चयन पर काफी हद तक निर्भर करता है. छंटनी मापदंडों पवित्रता और उपज की आवश्यकता के आधार पर समायोजित किया जा सकता है है. हालांकि FACS विशेष उपकरण और कर्मियों को प्रशिक्षण की आवश्यकता है, यह अत्यधिक सेल आबादी को शुद्ध करने के अलगाव के लिए पसंद की विधि है.

Protocol

प्रक्रिया को शुरू करने से पहले, निम्नलिखित मदों एकत्र की है और तैयार होने की जरूरत है:
1. बर्फ़
2. एकल रंग नियंत्रण धुंधला के लिए धुंधला हो जाना और कोशिकाओं 12 x 75 मिमी प्रवाह ट्यूबों के लिए 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों.
3. बफर धुंधला: फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) + 3% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS)
4. Pipettes
5. एफसी (यदि आवश्यक) ब्लॉक और धुंधला हो जाना एंटीबॉडी. एंटीबॉडी इष्टतम धुंधला के लिए titrated हो की जरूरत है.
6. मुआवजा मोती
7. सस्पेंशन बफर: हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HBSS) + 25 मिमी HEPES + 3% FCS
8. Trypan नीले और hemocytometer
9. सेल झरनी (40 सुक्ष्ममापी नायलॉन)
10. संग्रह ट्यूबों: संग्रह ट्यूबों के दो प्रकार 12) x 75 मिमी polystyrene (300 μl FCS और 25 मिमी HEPES युक्त) ट्यूब या ख) 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों (1 मिलीलीटर + 25 मिमी HEPES FCS युक्त) का इस्तेमाल किया जा सकता है उच्च सीरम एकाग्रता के साथ कोई अमीर मध्यम सॉर्ट किया गया कोशिकाओं के संग्रह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
शुरू सेल की आबादी का एक एकल कक्ष निलंबन उत्पन्न करता है.
वैकल्पिक: एक थोक शुद्धि ऐसे पूरक रिक्तीकरण या चुंबकीय छँटाई के रूप में विधि द्वारा वांछित सेल की आबादी के लिए समृद्ध है. संवर्धन कदम का मुख्य लाभ यह है कि यह तरह समय को कम कर देता है.
बफर धुंधला हो जाना के साथ कोशिकाओं को एक बार धो.
सतह पर तैरनेवाला त्यागें और एकाग्रता में बफर धुंधला कुशल धुंधला के लिए 50 x ¹⁰ 6 में कोशिकाओं resuspend .
वैकल्पिक: FCR के उच्च स्तर व्यक्त कोशिकाओं के लिए एक उपयुक्त अवरुद्ध पद्धति का उपयोग करके रिसेप्टर्स ब्लॉक. पसंद की एक विधि एक MAB का उपयोग है कि 10-15 मिनट के लिए बर्फ पर FcγR बांध है. ये एंटीबॉडी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं.
उपयुक्त MAB जोड़ें (एक पूर्व निर्धारित एकाग्रता में) वांछित सेल की आबादी दाग और बर्फ पर अंधेरे में 20-30 मिनट, धुंधला बफर के साथ दो washes के द्वारा बाद के लिए सेते हैं. वैकल्पिक: propidium आयोडाइड के रूप में एक महत्वपूर्ण डाई के साथ धुंधला, मृत कोशिकाओं (5) विचार करने के लिए शामिल किया जा सकता है. यदि बहु रंग धुंधला हो जाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, तो एकल रंग नियंत्रण के लिए आवश्यक हैं. हम बी.डी. CompBeads का उपयोग एकल रंग नियंत्रण निर्माता प्रोटोकॉल का उपयोग कर तैयार है.
यदि सीधे संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग नहीं, 7 कदम उचित माध्यमिक एंटीबॉडी या streptavidin संयुग्म का उपयोग दोहराएँ.
धोने के बाद, मध्यम संस्कृति में कोशिकाओं resuspend और सेल Trypan नीले रंग के रूप में एक महत्वपूर्ण डाई का उपयोग करते हुए एकाग्रता का निर्धारण.
15-20 के लिए सेल एकाग्रता समायोजित x ⁶ मिलीलीटर / 10. सेल आबादियों कि फार्म समूहों, जो छँटाई के दौरान साधन रोकना कर सकते हैं एक झरनी के माध्यम से कोशिकाओं को फ़िल्टर.
सेट अप और सेल सॉर्टर अनुकूलन. एक प्रवाह cytometer की स्थापना की प्रक्रिया के निर्माण पर निर्भर करता है विविध है और उचित रूप से प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा निष्पादित किया जाना चाहिए.
सामान्य सिफारिशें निम्नानुसार हैं:
1. उचित नोजल सेल करने के लिए हल किया जा प्रकार पर निर्भर करता है का चयन करें.
2. बाँझ बाँझ प्रकार के लिए, साधन.
3. प्रदर्शन साधन लेज़रों कामकाज कर रहे हैं सत्यापित करने के लिए मोतियों के साथ गुणवत्ता नियंत्रण, और यह सही छँटाई है.
4. आवश्यक संग्रह डिवाइस स्थापित और पक्ष धाराओं सेट.
5. साधन लेजर और डिटेक्टर स्थापित करने के लिए लेबल फ्लोरोसेंट कि इस्तेमाल किया जा सकता है (हमारे बी.डी. FACS Aria तीन पराबैंगनीकिरण है और नौ रंगों को पता लगा सकते हैं) का निर्धारण को देखो.
6. एक बार जब यह निर्धारित किया जाता है क्या फ्लोरोसेंट लेबल सेल सॉर्टर पर इस्तेमाल किया जाएगा, मुआवजा (के रूप में नीचे समझाया) किया जा सकता है.
नकारात्मक नियंत्रण नमूना और एक सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग कर मुआवजा प्रदर्शन. मुआवजा दो डिटेक्टरों के बीच स्पेक्ट्रम ओवरलैप को हटाने के लिए आवश्यक है. यह प्रासंगिक है ध्यान दें कि मुआवजे सबूत मूर्ख नहीं है और प्रतिकूल कैसे दाग चमकीले कुछ मार्करों, और कोशिकाओं है कि कम autofluorescence जो मंद और नकारात्मक आबादी के बीच गरीब संकल्प के लिए नेतृत्व कर सकते हैं है की प्रतिदीप्ति द्वारा प्रभावित है.
सर्वोत्तम परिणामों के लिए, प्रयोगात्मक डिजाइन मार्करों कि कम अभिव्यक्ति है या कि एक ज्ञात धुंधला पैटर्न नहीं है के साथ उज्ज्वल fluorochromes का उपयोग शामिल होना चाहिए. मार्करों कि सेल आबादी और अत्यधिक व्यक्त कर रहे हैं के बीच अच्छा जुदाई प्रदान डिमर जैसे लाल या बैंगनी लेज़रों से उत्साहित लोगों fluorochromes के साथ किया जाना चाहिए.
1. मुआवजा मुआवजा मोती, जो कि माउस से पुलिस महानिरीक्षक के कापा प्रकाश श्रृंखला, चूहे, चूहे / या हम्सटर के लिए एक विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए युग्मित किया गया है polystyrene microparticles के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है है. मोती आसान दाग, एक मजबूत संकेत है और एकल दाग नियंत्रण है कि प्रयोगात्मक नमूने के रूप में एक ही fluorophore की तैयारी का एक आसान तरीका प्रदान करते हैं.
2. एक टेम्पलेट है कि एक bivariate साजिश के लिए आगे तितर बितर (FSC) और पक्ष तितर बितर (एसएससी), और एक हिस्टोग्राम प्रदर्शित शामिल सेटप्रत्येक fluorochrome है कि इस्तेमाल किया जा जाएगा.
3. नकारात्मक नियंत्रण ट्यूब चलाने के लिए और आगे तितर बितर (FSC) और साइड (एसएससी) तितर बितर करने के लिए बड़े पैमाने पर ब्याज की आबादी जगह समायोजित.
4. प्रतिदीप्ति PMT सेटिंग्स समायोजित करने के लिए नकारात्मक या दूर छोड़ दिया हिस्टोग्राम के हाथ भाग में जनसंख्या autofluorescence जगह.
5. नकारात्मक नियंत्रण ट्यूब रिकार्ड.
6. भागो एकल सकारात्मक नियंत्रण ट्यूबों और प्रत्येक ट्यूब के लिए डेटा रिकॉर्ड.
7. हिस्टोग्राम पर डेटा के सकारात्मक भाग, और हिस्टोग्राम के नकारात्मक हिस्से पर एक अंतराल गेट के चारों ओर एक अंतराल फाटक ड्रा.
8. मैनुअल मुआवजा समायोजन करके किया जाता है मंझला सकारात्मक (औसत केंद्रीय प्रवृत्ति की एक लघुगणकीय पैमाने पर मतलब की तुलना में एक बेहतर अनुमान है) जब तक यह नकारात्मक की औसत के बराबर है. यह fluorochrome प्रयोग में इस्तेमाल किया लेबल में से प्रत्येक के लिए किया जाना चाहिए.
9. मंझला समायोजित करने के लिए, वर्णक्रमीय ओवरलैप मान समायोजित या तो उच्च या कम जब तक प्रत्येक फ्लोरोसेंट पैरामीटर मैच के लिए medians के रूप में निकटता के रूप में संभव है.
10. मुआवजा भी विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ स्वचालित रूप से किया जा सकता है. स्वचालित मुआवजा मुआवजा नियंत्रण से दर्ज डेटा का उपयोग करता है प्रयोग में इस्तेमाल सभी fluorophores के लिए एक बीजीय मैट्रिक्स गणना. इन मूल्यों के बाहर गैर प्राथमिक रंग है कि डिटेक्टर में एक प्राथमिक रंग खून बह रहा हैं योगदान घटाना करने के लिए उपयोग किया जाता है.
प्रयोगात्मक नमूना करने के लिए हल किया जा रिकार्ड और gating उपकरण और subsetting तरीकों का उपयोग करने के लिए ब्याज की आबादी को परिभाषित.
1. एक डॉट साजिश है कि FSC बनाम एसएससी प्रदर्शित करता है और ब्याज की आबादी फाटक के लिए एक gating उपकरण, बहुभुज, आयत अंतराल, या वृत्त का चतुर्थ भाग का उपयोग करें के साथ प्रयोगात्मक टेम्पलेट सेट करें. तितर बितर साजिश जो सेल प्रकार के लिए अलग सेल के भौतिक गुणों को प्रदर्शित करता है.
2. प्रतिदीप्ति gating रणनीति तय करने का सबसे अच्छा तरीका प्रतिदीप्ति ऋण एक नियंत्रण (FMO) का उपयोग करने के लिए है. FMO नियंत्रण ट्यूब में सभी अभिकर्मकों कि प्रयोग में उपयोग किया जाता है ब्याज की एक के अलावा शामिल हैं. FMO dimly दाग आबादी और व्यापक नकारात्मक आबादी के बीच भेदभाव करने में मदद करता है है.
3. FMO ट्यूब से दर्ज करने के लिए निर्धारित जहां प्रयोगात्मक ट्यूब के भीतर फाटक की जगह के लिए डेटा का प्रयोग करें.
एक बार फाटक निर्धारित किया गया है, फाटकों बाहरी संग्रह ट्यूबों में छँटाई के लिए चुना जा सकता है है. चार द्वार आबादी (या) के लिए उपलब्ध इंस्ट्रूमेंटेशन के आधार पर एक समय में हल किया जा सकता है.
4 में प्रयोगात्मक नमूना ट्यूब भागो ° सी, विक्षेपन प्लेटों पर बारी है, और नमूना सॉर्ट. 5 x 10 ⁵ -1.5 x 10 ⁶ कोशिकाओं एक 12 x 75 मिमी ट्यूब और 1.5 में हल किया जा सकता है 10 ^{x 6} - 4,5 x ^{10 6} कोशिकाओं एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार में हल किया जा सकता है है.
एक बार कोशिकाओं के अपेक्षित संख्या में प्राप्त किया गया है, मैन्युअल रूप से छँटाई रोक.
बाद सॉर्ट विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए सॉर्ट किया गया कक्ष आबादी की शुद्धता निर्धारित.

प्रतिनिधि परिणाम

हम यहाँ माउस प्लीहा - संबंधी बी और CD4 टी सेल छँटाई (चित्रा 1) के लिए परिणाम से पता चला है. Splenocytes पीई टेक्सास लाल संयुग्मित विरोधी माउस B220, FITC संयुग्मित विरोधी माउस TCRβ और विरोधी माउस Alexafluor 700 संयुग्मित सीडी 4 बी कोशिकाओं (B220 + TCRβ) और CD4 टी कोशिकाओं (सीडी 4 + TCRβ + पहचान के साथ दाग थे ). छँटाई बी.डी. FACS Aria साधन के साथ प्रदर्शन किया था. बी सेल शुद्धता छँटाई के बाद> 97% और CD4 टी सेल शुद्धता> 98% था.

चित्रा 1. प्लीहा - संबंधी बी कोशिकाओं और CD4 की पवित्रता FACS बाद कोशिकाओं टी माउस splenocytes विरोधी माउस B220 TCRβ और CD4 एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे. . बी कोशिकाओं के लिए FACS एक बी.डी. FACS Aria का उपयोग B220 पर gating के द्वारा प्रदर्शन किया गया था + TCRβ कोशिकाओं (छवि 1A, बाईं पैनल, कम सही कोण नापने का यंत्र). एक पोस्ट सॉर्ट विश्लेषण बी कोशिकाओं (छवि 1A, सही पैनल) की शुद्धता निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन किया था. B220 धुंधला x-अक्ष और y-अक्ष पर TCRβ धुंधला पर दिखाया गया है. CD4 टी कोशिकाओं के लिए FACS एक ही प्रवाह cytometer का उपयोग पर gating द्वारा किया गया था TCRβ सीडी 4 + + कोशिकाओं (छवि 1B, बाईं पैनल, ऊपरी दाएँ वृत्त का चतुर्थ भाग). एक पोस्ट सॉर्ट विश्लेषण CD4 टी कोशिकाओं (छवि 1B, सही पैनल) की शुद्धता निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन किया था. TCRβ धुंधला x-अक्ष और y-अक्ष पर धुंधला CD4 पर दिखाया गया है. प्रत्येक चक्र में प्रतिशत सकारात्मक कोशिकाओं से पता चला है.