Summary
Les aspects techniques du spectacle LIPS (Systèmes immunoprécipitation luciférase) sont décrits. L'approche globale consiste à exprimer des gènes codant pour des antigènes chimériques fusionnées à luciférase de Renilla (RUC) dans les cellules de mammifères. Ruc-antigène brut extraits sont ensuite préparés et, sans purification, employées dans des essais d'immunoprécipitation de quantifier les anticorps.
Abstract
Technologies pour complètement comprendre et quantifier les profils anticorps à des auto-antigènes et les agents infectieux peuvent produire de nouvelles connaissances sur les mécanismes de la maladie et peut éclairer de nouveaux marqueurs à substratify maladie avec différentes caractéristiques cliniques et de mieux comprendre la pathogenèse. Nous avons développé une méthode hautement quantitative appelés systèmes immunoprécipitation luciférase (LIPS) pour le profilage des patients réponses anticorps sérum à des autoantigènes et les antigènes des pathogènes associés à l'infection. Contrairement ELISA, les lèvres très sensibles est facilement mis en œuvre pour l'enquête humorale profils de réponse sérologique aux antigènes différents dans un format universel et produit le titre d'anticorps dynamique des distances allant jusqu'à 6 log
Protocol
1. Aperçu schématique:
Cette vidéo montre les étapes nécessaires à réaliser le dosage LIPS. Les antigènes sont exprimés dans les cellules COS1 que la luciférase de Renilla recombinante (RUC)-antigène fusions, et des extraits bruts sont obtenus et utilisés sans purification. Le dosage de LIPS est initiée par l'incubation crud e Ruc-antigène des extraits avec des sérums de patients dans les puits de microtitration. Le mélange antigène-anticorps est ensuite transférée à une plaque de 96 puits filtre contenant la protéine A / G perles pour capturer les molécules d'IgG. Après avoir lavé le filtre à plaques contenant la protéine, un anticorps / G perles, liée Ruc-antigène est mesurée par l'addition du substrat coelentérazine et les unités de la lumière sont mesurées avec un luminomètre.
PARTIE 1: La transfection de plasmides pour la production de protéines de fusion Renilla-antigène
Set-up: COS1 cellules sont cultivées dans du DMEM-FCS 10% en utilisant des protocoles standard de culture de tissus. Plasmides pour Renilla luciférase fusions ont été décrits précédemment 1. ADN de ces plasmides est préparé en utilisant un kit de Qiagen Midiprep. Le rendement devrait être d'environ 1 mg -3. Mesurer la concentration d'ADN et de stocker en tant que mg 1000 / ml de solution concentrée à -20 ° C.
Procédure:
- Un jour avant la transfection Cos-1, diviser les cellules en nouvelle 100 x 20 mm plats à environ 2 x 10 6 par plaque et incuber à 37 ° C.
- Le jour suivant, les cellules COS-1 devrait être de 80-95% confluentes. Étiquette tubes de 1,5 ml de microcentrifugation en polypropylène pour chaque ADN plasmidique à transfecter. Laisser le réactif de transfection FuGENE-6, qui est stocké à 4 ° C, se réchauffer à température ambiante.
- Ajouter 94 ul d'Opti-MEM médias pour chaque tube de centrifugeuse. Ensuite, ajoutez 6 pl d'FuGENE 6 aux médias Opti-MEM sans toucher la paroi latérale.
- Incuber le mélange pendant 5 minutes à température ambiante.
- Ajouter 1-2 ug (en stock ADN 1mg/ml) du plasmide de fusion antigène Renilla luciférase construire. Mélanger et incuber le mélange pendant 15 minutes à température ambiante.
- Transférer la solution d'ADN-FuGENE 6 Opti-MEM pour les cellules en la goutte uniformément dans les médias de l'COS1 cellules.
PARTIE 2: Récolte Renilla-antigène Fusions
- Deux jours après transfection, les cellules COS-1 sont récoltées. Ceci est initiée par la suppression des médias et puis à rincer les cellules avec 6 ml de PBS. Après décantation du PBS, une pipette de suite tout résidu PBS de la boîte de culture tissulaire.
- Ajouter 1,4 ml de tampon de lyse froid composé de 50 mM Tris, pH 7,5, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM, 1% de Triton X-100, glycérol 50%, et les inhibiteurs de protéase (2 comprimés de cocktail miniprotease inhibiteur de terminer par 50 ml de tampon de lyse). Récolte des cellules avec un racloir cellulaire et transférer rapidement la moitié de la lysat à chacun des deux tubes de 1,5 ml de microcentrifugation sur la glace.
- Un Sonifier Branson 150 est utilisée pour briser les cellules ouvertes. Placer le microtube contenant le lysat cellulaire sur la glace et le pouls pendant 5 sec, 5 sec et 5 sec avec les réglages sonication de 2, 2 et 4, respectivement.
- Centrifuger le lysat cellulaire à 12 500 RPM pour deux rotations 4 minute à 4 ° C. Après la première rotation, retourner doucement les tubes pour éliminer les débris lâchement de la paroi latérale du tube. Après la seconde vrille, transférer soigneusement le surnageant, sans perturber le culot, à partir de deux tubes d'un tube de micro nouvelles sur la glace.
- Calculer les unités légères (UGB) par de lysat. Pour mesurer la LU, diluer 1 de lysat avec 8 pi de PBS dans un tube de centrifugeuse de nouvelles. Directement ajouter 100 ul de substrat 1X coelentérazine au mélange dilué et mesurer immédiatement la luminescence dans le tube en utilisant un luminomètre tubes (20/20 n Turner scientifique) avec une lecture de 5 secondes.
- Stocker le lysat Ruc-antigène à -20 ° C pendant 1-2 jours ou stocker pour une longue période de temps en aliquots à -80 ° C.
PARTIE 3: Préparer une plaque de Sera maître
- Faites une plaque maître sérums en ajoutant d'abord 450 pi de tampon A (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM, 1% Triton X-100) dans chaque puits d'une plaque de 96 puits profonds polypropylène microtitration . À cette étape, un colorant, rouge de phénol, peuvent également être inclus dans le tampon A (concentration finale est de 0,2 ug / ml dans le tampon A) pour agir comme un traceur pour la surveillance future ajout de l'échantillon des sérums et autres étapes de l'essai LIPS.
- Ensuite, ajoutez 50 pl de sérum de chaque échantillon dans les puits différents contenant 450 pi de tampon A. Notez que ceci est une dilution 1:10 de l'sérum dans le tampon A. Typiquement sérums ne sont pas ajoutées aux deux derniers puits de la plaque maître car ceci est réservé pour les blancs de mémoire tampon.
- Avant d'utiliser la plaque de maître, il est largement ébranlée (1-2 heures) sur une plate-forme des rotateurs. Le sérum de la plaque maître est stable pour au moins 1 mois (ou plus) à 4 ° C, si stocké correctement pour éviter l'évaporation.
- Comme décrit ci-dessous, cette plaque maître fournit 10 l de sérum dilué à plusieurs reprises enlevé pour le profilage des sérums dirigés contre les antigènes multiples. Plaques maîtres grands et petits peuvent aussi être employées. Sceller la plaque bien avec Parafilm quand il n'est pas utilisé.
PARTIE 4: dosage de LIPS
- Polypropylène 96-superficielle des plaques de microtitration et sont utilisés pour tester les sérums. Dans la première étape, ajouter 40 ul de tampon A dans chaque puits de la plaque de 96 puits en utilisant une micropipette à 8 canaux.
- Prenez ensuite 10 ul de dilution des sérums (1 équivalent ul sérums) de la plaque de maître et de l'ajouter directement à chaque puits de la plaque de travail en utilisant une micropipette à 8 canaux.
- Un mélange maître contenant l'extrait de Ruc-antigène est la prochaine formulé tel que 1 x 10 7 unités de lumière (LU) est ajouté dans 50 ul de tampon A dans chaque puits. Basse entrées (aussi peu que 1 x 10 6) peut également être utilisé, mais entraîner une baisse de plage dynamique. Faire ce mélange maître et la pipette 50 ul d'Ruc-antigène mélange à chaque puits.
- Incuber la plaque sur un agitateur rotatif pendant 1 heure à température ambiante.
- Durant l'incubation, ajouter 5 pi d'une suspension de 30% de protéines Ultralink A / G perles (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) dans le PBS au fond de chaque puits d'une nouvelle plaque filtrante 96 puits HTS (Millipore, Bedford, MA) .
- Après l'incubation de 1 heure, le transfert des 100 ul Ruc-antigène des anticorps mélange réactionnel plaques à 96 puits HTS filtre contenant la protéine A / G perles en utilisant une micropipette à 8 canaux.
- Incuber la plaque de 96 puits de filtre sur un agitateur rotatif pendant 1 heure supplémentaire à température ambiante.
- Laver ensuite la plaque de filtre sur une rampe à vide. Chaque puits est lavé 8 fois avec 100 pi de tampon A, suivie par deux fois avec 100 ul de PBS. Ceci peut être réalisé manuellement ou avec une station de pipetage robotique.
- Après le dernier lavage, le vide est éteint. Retirer la plaque de filtration et de tamponner sec en utilisant une pile de serviettes en papier ou papier filtre en veillant à éliminer l'humidité sur le haut et le bas de la plaque.
PARTIE 5: Mesure de l'analyse des données et de luminescence
Set-up:
Un LB Berthold microplaques 960 Centro luminomètre est utilisé pour déterminer la luminescence dans chaque puits en utilisant un seul injecteur. Une fois que la machine est en marche, rincez à l'eau distillée de l'injecteur H 2 O en utilisant le cycle de lavage injecteur. Substrat coelentérazine est préparé en utilisant le kit Promega substrat Renilla comme décrit par le fabricant. Typiquement 6 ml de mélange de substrat coelentérazine 1X (soit 60 actions coelentérazine ul + 6 ml de tampon 1X) est préparé pour l'amorçage de la machine et exécutant l'un assiette pleine de 96 puits. Avant d'analyser la plaque, le LB 960 Berthold microplaques Centro luminomètre est amorcée avec 1X substrat coelentérazine. Ouvrir un fichier contenant la configuration du programme pour l'injection du substrat et de la lecture de la plaque. Pour ces mesures, 50 ul de substrat coelentérazine est injecté, la plaque est agitée pendant 2 secondes, suivie par une seconde lecture de la luminescence 5.
- Bien que le luminomètre plaque a la capacité de lire la plaque entière, une lecture partielle de la plaque peut également être sélectionné (sous le menu lecture). Démarrez le programme, ce qui déclenche la lecture de la plaque.
- Après la course, enlever la plaque filtrante de microtitration rapidement pour éviter tout déversement dans le luminomètre. Exporter les données générées avec le programme MikroWin dans un format Excel pour l'analyse.
- Nous vous recommandons d'évaluer les sérums des deux manches indépendant. Les données sont ensuite moyennées pour générer les valeurs titre LU pour chaque échantillon. Ces valeurs peuvent encore être ajusté pour soustraire les blancs de mémoire tampon.
- Complémentaires d'analyse de données telles que la détermination de la coupure peut être calculée en prenant la moyenne plus de 3 ou 5 écarts-types des valeurs de contrôle.
Discussion
LIPS nécessite l'optimisation des essais minime et, en raison de sa simplicité, les données de haute qualité peuvent généralement être générés en utilisant les lèvres en moins de deux semaines pour tout antigène donné. Les étapes les plus consommatrices de temps sont le clonage et la génération du vecteur d'expression approprié plasmide contenant la fusion Ruc-antigène. Une fois ces plasmides sont générés, les antigènes simples ou multiples peuvent être rapidement testé avec les lèvres comme décrit ci-dessus. Il est à noter que les lèvres est assez polyvalent tels que les sérums peuvent également être testés dans un format tube ou encore sur une plaque de microtitration avec filtre à l'aide d'un poste de travail robotique Biomek 2 ou un laveur de plaques de filtration sous vide. Ce système hautement évolutif permet l'lèvres parallèles profilage d'un panel d'autoantigènes humaine 3 ou le protéome entier d'un quatre virus. Il est probable que de nombreux profils d'anticorps différents générés par LIPS sera utile pour le diagnostic de 3-9, antigène de la découverte 9, suivant le cours d'un traitement de 10, la surveillance des vaccins et a de larges implications pour des maladies spécifiques et pour la santé publique en général.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par le Programme de recherche intra-muros de l'NIDCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HiSpeed Plasmid Midi KIt | Qiagen | 12643 | |
| 100 x 20 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985 | |
| FuGENE 6 | Roche Group | 1814443 | |
| Complete, Mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11836153001 | |
| Polypropylene 96 DeepWell 1 ml plate | Fisher Scientific | 12-566-120 | Deep well plate with lid and seal with Parafilm |
| Polypropylene microtiter plate | Fisher Scientific | 12-566-120 | |
| HTS Filter plate | EMD Millipore | MSBVN1B50 | |
| Ultralink Immobilized Protein A/G | Pierce, Thermo Scientific | 53133 (10ml) | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega Corp. | E2820 | For 2000 assays |
| Centro microplate luminometer | Berthold Technologies | LB 960 |
References
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