Summary
होंठ (luciferase immunoprecipitation सिस्टम) प्रदर्शन के तकनीकी पहलुओं का वर्णन कर रहे हैं. समग्र दृष्टिकोण chimeric स्तनधारी कोशिकाओं में Renilla luciferase (Ruc) के लिए जुड़े हुए प्रतिजनों जीन एन्कोडिंग व्यक्त शामिल है. क्रूड Ruc प्रतिजन अर्क और फिर तैयार हैं, शुद्धि के बिना, immunoprecipitation assays में कार्यरत एंटीबॉडी यों.
Abstract
व्यापक समझ और बढ़ाता autoantigens और संक्रामक एजेंटों के लिए एंटीबॉडी प्रोफाइल के लिए प्रौद्योगिकी रोग तंत्र में नए अंतर्दृष्टि उपज और नए मार्करों स्पष्ट करने के लिए विभिन्न नैदानिक सुविधाओं के साथ रोग substratify और बेहतर रोगजनन समझने हो सकता है. हम एक उच्च मात्रात्मक विधि autoantigens और रोगज़नक़ संक्रमण के साथ जुड़े प्रतिजनों के लिए रोगी सीरा एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं की रूपरेखा के लिए luciferase immunoprecipitation सिस्टम (होंठ) कहा जाता है विकसित किया है. ELISAs के विपरीत, अत्यधिक संवेदनशील होंठ आसानी से एक सार्वभौमिक स्वरूप में विभिन्न प्रतिजनों के लिए humoral सीरम वैज्ञानिक प्रतिक्रिया प्रोफाइल सर्वेक्षण कार्यान्वित किया जाता है और गतिशील एंटीबॉडी टिटर का उत्पादन 6 लॉग करने के लिए पर्वतमाला
Protocol
1. योजनाबद्ध अवलोकन:
यह वीडियो होंठ परख प्रदर्शन में शामिल कदम दर्शाता है. प्रतिजनों पुनः संयोजक Renilla (Ruc) luciferase - प्रतिजन fusions, और कच्चे तेल के अर्क के रूप में Cos1 कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं प्राप्त कर रहे हैं और शुद्धि के बिना इस्तेमाल किया. होंठ परख microtiter कुओं में रोगी सीरा के साथ crud ई Ruc प्रतिजन अर्क incubating द्वारा शुरू की है . मिश्रण प्रतिरक्षी - प्रतिजन तो एक 96 अच्छी तरह से फिल्टर ए / जी मोती प्रोटीन युक्त आईजीजी अणुओं पर कब्जा थाली करने के लिए स्थानांतरित किया है. फिल्टर प्रोटीन युक्त थाली धोने के बाद एक / जी मोती, एंटीबॉडी बाध्य Ruc प्रतिजन coelenterazine सब्सट्रेट और प्रकाश इकाइयों के अलावा द्वारा मापा जाता है एक luminometer के साथ मापा जाता है.
भाग 1: प्लास्मिड Renilla एंटीजन फ्यूजन प्रोटीन के उत्पादन के लिए अभिकर्मक
सेट अप: Cos1 कोशिकाओं DMEM - 10% मानक टिशू कल्चर प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए FCS में सुसंस्कृत हैं. प्लास्मिड Renilla luciferase fusions के लिए एक पहले से वर्णित किया गया है. इन plasmids के लिए डीएनए Qiagen से Midiprep किट का उपयोग करने के लिए तैयार है. उपज लगभग 1 -3 मिलीग्राम होना चाहिए. 1000 μg / -20 डिग्री सेल्सियस पर मिलीलीटर शेयर समाधान के रूप में डीएनए एकाग्रता और दुकान उपाय
प्रक्रिया:
- एक दिन पहले अभिकर्मक, विभाजन, क्योंकि एक 100 नए सी. x लगभग 2 एक्स 10 37 प्रति प्लेट और सेते 6 में 20 मिमी व्यंजन ° में कोशिकाओं
- अगले दिन पर, क्योंकि एक - कोशिकाओं 80-95% मिला हुआ होना चाहिए. लेबल प्रत्येक प्लास्मिड डीएनए के लिए 1.5 मिलीलीटर polypropylene microfuge ट्यूबों ट्रांसफ़ेक्ट. अभिकर्मक FuGENE 6 अभिकर्मक, ° जो 4 में संग्रहीत किया जाता है सी, कमरे Temp को गर्म करने के लिए अनुमति दें.
- प्रत्येक microfuge ट्यूब Opti-सदस्य मीडिया के 94 μl जोड़ें. अगले ओर दीवार को छू के बिना मीडिया Opti-सदस्य FuGENE 6 के 6 μl जोड़ें.
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मिश्रण को सेते हैं.
- Renilla luciferase प्रतिजन संलयन के लिए प्लाज्मिड की 1-2 (1mg/ml डीएनए स्टॉक से) μg निर्माण जोड़ें . मिलाई और फिर कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं.
- कोशिकाओं को यह Cos1 कोशिकाओं के मीडिया में समान रूप से टपकता डीएनए - FuGENE 6-Opti-सदस्य समाधान स्थानांतरण.
भाग 2: फसल काटने वाले fusions Renilla - प्रतिजन
- अभिकर्मक के दो दिन बाद, क्योंकि - 1 कोशिकाओं harvested रहे हैं. यह मीडिया को हटाने और फिर और पीबीएस के 6 मिलीलीटर के साथ rinsing कोशिकाओं के द्वारा शुरू की है. पीबीएस decanting के बाद, टिशू कल्चर पकवान से दूर किसी भी अवशिष्ट पीबीएस विंदुक.
- ठंड lysis बफर के 1.4 मिलीलीटर 50 मिमी Tris, 7.5 पीएच, 100 मिमी NaCl, 5 मिमी 2 MgCl, ट्राइटन% 1 X-100, 50% ग्लिसरॉल और protease inhibitors (50 मिलीलीटर प्रति पूरा miniprotease अवरोध करनेवाला कॉकटेल की 2 गोलियों की रचना जोड़ें lysis बफर). एक सेल scrapper के साथ हार्वेस्ट कोशिकाओं और जल्दी से बर्फ पर दो 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूबों के प्रत्येक lysate के आधे हस्तांतरण.
- एक Branson 150 Sonifier कोशिकाओं को खुला तोड़ने के लिए प्रयोग किया जाता है. Microcentrifuge 2 2, और 4 के sonication सेटिंग्स के साथ बर्फ और नब्ज पर 5 सेकंड, 5 सेकंड और 5 सेकंड के लिए सेल lysate युक्त, क्रमशः ट्यूब रखें.
- 4 में दो 4 मिनट spins डिग्री सेल्सियस के लिए सेल lysate 12,500 RPM में पहली स्पिन के बाद, धीरे ट्यूबों पलटना ट्यूब के sidewall से शिथिल संलग्न मलबे को हटाने के लिए अपकेंद्रित्र. स्पिन के बाद दूसरा, ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण, गोली में बाधा पहुँचा के बिना, दो नलियों से बर्फ पर एक नया microfuge ट्यूब.
- Lysate के μl प्रति प्रकाश इकाइयों (लू) की गणना. लू को मापने के लिए, एक नया microfuge ट्यूब में 8 पीबीएस के μl के साथ lysate के एक μl पतला. सीधे पतला मिश्रण 1X coelenterazine सब्सट्रेट के 100 μl को जोड़ने और तुरंत एक 5 सेकंड पढ़ा के साथ एक ट्यूब luminometer (20/20 पता टर्नर वैज्ञानिक) का उपयोग कर ट्यूब में luminescence उपाय.
- Aliquots में समय की लंबी अवधि के लिए 1-2 दिनों या दुकान के लिए -80 में -20 डिग्री सेल्सियस पर Ruc प्रतिजन lysate स्टोर डिग्री सेल्सियस
भाग 3: सीरा मास्टर प्लेट की तैयारी
- (50 मिमी Tris, 7.5 पीएच, 100 मिमी NaCl, 5 मिमी 2 MgCl,% 1 Triton एक्स 100) 96 गहरे अच्छी तरह से एक polypropylene microtiter प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए पहली बफर के 450 μl जोड़ने के द्वारा एक सीरा मास्टर प्लेट . इस चरण में, एक डाई, Phenol लाल, भी बफर में शामिल किया जा सकता है भविष्य सीरा नमूना इसके अलावा और होंठ परख के अन्य चरणों की निगरानी के लिए एक अनुरेखक के रूप में कार्य करने के लिए (अंतिम एकाग्रता 0.2 / बफर में μg मिलीलीटर एक है).
- अगला प्रत्येक नमूने से अलग बफर ए के 450 μl युक्त कुओं को सीरा के 50 μl जोड़ने के नोट: इस बफर ए में सीरा के 1:10 कमजोर पड़ने आमतौर पर सीरा मास्टर प्लेट के पिछले दो कुओं से नहीं जोड़ा है क्योंकि इस बफर कारतूस के लिए आरक्षित है.
- मास्टर प्लेट का उपयोग करने से पहले, यह एक अंग को घुमानेवाली पेशी मंच पर बड़े पैमाने पर हिल रहा है (1-2 घंटे). स्टेशन मास्टर की थाली में सीरम है4 में कम से कम 1 month (या अब) डिग्री सेल्सियस, अगर सही ढंग से संग्रहीत करने वाष्पीकरण को रोकने के लिए ble.
- जैसा कि नीचे वर्णित है, इस मास्टर प्लेट पतला करने के लिए बार बार कई प्रतिजनों के खिलाफ सीरा की रूपरेखा के लिए हटाया जा सीरा के 10 μl प्रदान करता है. बड़े और छोटे गुरु प्लेटें भी नियोजित किया जा सकता है. Parafilm के साथ अच्छी तरह से थाली जब यह प्रयोग किया जा रहा नहीं है सील.
4 हिस्सा: होंठ परख
- Polypropylene 96 उथले अच्छी तरह से microtiter प्लेट सीरा परीक्षण किया जाता है. पहले चरण में 96 अच्छी तरह से एक 8 चैनल micropipette का उपयोग प्लेट की हर अच्छी तरह से एक बफर के 40 μl जोड़ें.
- अगला मास्टर थाली से पतला सीरा (1 μl सीरा समकक्ष) के 10 μl ले और यह काम एक 8 चैनल micropipette का उपयोग कर प्लेट में से प्रत्येक अच्छी तरह से सीधे जोड़ने.
- मास्टर Ruc - प्रतिजन निकालने युक्त मिश्रण अगले ऐसे तैयार की है कि 1 एक्स 10 7 प्रकाश इकाइयों (लू) बफर के 50 μl में हर अच्छी तरह से जोड़ा जाता है. लोअर आदानों (के रूप में छोटे 1 के रूप में 10 x 6) भी, प्रयोग किया जा सकता है लेकिन एक कम गतिशील रेंज में परिणाम . इस मास्टर मिश्रण और विंदुक 50 μl Ruc प्रतिजन मिश्रण के प्रत्येक अच्छी तरह से बनाओ.
- कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एक रोटरी प्रकार के बरतन पर थाली सेते हैं.
- ऊष्मायन के दौरान, एक नया 96 में अच्छी तरह से फिल्टर HTS प्लेट (Millipore, Bedford, MA) के प्रत्येक अच्छी तरह के नीचे करने के लिए 5 Ultralink प्रोटीन ए / मोती पीबीएस में जी (पियर्स जैव प्रौद्योगिकी, रॉकफोर्ड, आईएल) के एक 30% निलंबन की μl जोड़ने .
- 1 घंटे ऊष्मायन के बाद, 96 अच्छी तरह से फिल्टर HTS प्लेटें युक्त प्रोटीन ए / जी मोतियों का उपयोग एक 8 चैनल micropipette 100 μl एंटीबॉडी Ruc प्रतिजन प्रतिक्रिया मिश्रण का हस्तांतरण.
- कमरे के तापमान पर एक अतिरिक्त घंटे के लिए एक रोटरी प्रकार के बरतन पर 96 अच्छी तरह से फिल्टर प्लेट सेते हैं.
- अगले एक वैक्यूम कई गुना पर फ़िल्टर थाली धो लो. हर अच्छी तरह से बफर एक के 100 μl के साथ 8 बार धोया जाता है, पीबीएस के 100 μl के साथ दो बार द्वारा पीछा किया. यह मैन्युअल रूप से या एक रोबोट pipetting वर्कस्टेशन के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है है.
- पिछले धोने के बाद, निर्वात बंद कर दिया है. फ़िल्टर थाली निकालें और यह कागज तौलिए या फिल्टर कागज और प्लेट के ऊपर या नीचे पर नमी हटाने सुनिश्चित करने के ढेर का उपयोग कर शुष्क दाग.
भाग 5: माप Luminescence और डेटा विश्लेषण
सेट अप:
एक Berthold लेग 960 Centro microplate luminometer प्रत्येक अच्छी तरह से एक एकल सुई लगानेवाला का उपयोग करने में luminescence का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. एक बार मशीन पर है, आसुत एच 2 हे के साथ सुई लगानेवाला कुल्ला इंजेक्टर धोने चक्र का उपयोग कर. Coelenterazine सब्सट्रेट Promega Renilla सब्सट्रेट के रूप में निर्माता द्वारा वर्णित किट का उपयोग करने के लिए तैयार है. आमतौर पर 1X coelenterazine सब्सट्रेट मिश्रण के 6 मिलीग्राम (यानी 60 μl coelenterazine शेयर प्लस 1X बफर के 6 मिलीग्राम) मशीन भड़काना के लिए तैयार है और एक पूर्ण 96 अच्छी तरह से थाली चलाने. थाली का विश्लेषण करने से पहले, Berthold लेग 960 Centro microplate luminometer 1X coelenterazine सब्सट्रेट के साथ primed है. एक कार्यक्रम सब्सट्रेट इंजेक्शन और प्लेट पढ़ने के लिए सेटिंग युक्त फ़ाइल खोलें. इन मापों के लिए, coelenterazine सब्सट्रेट के 50 μl इंजेक्शन है, थाली 2 सेकंड, luminescence के एक 5 पढ़ा सेकंड द्वारा पीछा के लिए हिल रहा है.
- हालांकि थाली luminometer पूरी थाली पढ़ने की क्षमता है, थाली के एक आंशिक पढ़ा भी (पढ़ा मेनू के तहत) का चयन किया जा सकता है. कार्यक्रम है, जो प्लेट के पढ़ने शुरू शुरू करो.
- चलाने के बाद, microtiter फ़िल्टर थाली तुरंत निकाल luminometer में spillage को रोकने के. निर्यात डेटा विश्लेषण के लिए एक एक्सेल प्रारूप में MikroWin कार्यक्रम के साथ उत्पन्न.
- हम दो स्वतंत्र रन से सीरा का मूल्यांकन सलाह देते हैं. डेटा तो प्रत्येक नमूना के लिए लू टिटर मूल्यों को उत्पन्न करने के लिए औसत है. इन मूल्यों को आगे के लिए बफर खाली घटाना करने के लिए समायोजित किया जा सकता है.
- Cutoff मतलब अधिक नियंत्रण मूल्यों की 3 या 5 मानक विचलन लेने के द्वारा परिकलित किया जा सकता निर्धारण के रूप में अतिरिक्त डेटा विश्लेषण.
Discussion
होंठ न्यूनतम परख अनुकूलन और अपनी सादगी की वजह से, उच्च गुणवत्ता वाले डेटा को आम तौर पर होंठ किसी भी प्रतिजन के लिए दो सप्ताह से कम का उपयोग करके उत्पन्न किया जा सकता है की आवश्यकता है. सबसे अधिक समय लेने चरणों क्लोनिंग कर रहे हैं और उपयुक्त प्लाज्मिड अभिव्यक्ति वेक्टर Ruc - प्रतिजन संलयन युक्त पैदा. एक बार इन plasmids उत्पन्न कर रहे हैं, एक या कई प्रतिजनों तेजी से होंठ के साथ परीक्षण किया जा सकता है ऊपर वर्णित के रूप में. यह नोट किया जाए कि होंठ काफी बहुमुखी है ऐसी है कि सीरा एक ट्यूब स्वरूप में या वैकल्पिक रूप से एक BIOMEK रोबोट 2 वर्कस्टेशन या वैक्यूम निस्पंदन के साथ एक थाली वॉशर की सहायता के साथ एक microtiter फ़िल्टर थाली पर भी परीक्षण किया जा सकता है चाहिए. यह बेहद परिमाप्य प्रणाली समानांतर मानव autoantigens 3 या एक वायरस 4 के पूरे proteome के एक पैनल की रूपरेखा होंठ के लिए अनुमति देता है . यह संभावना है कि कई अलग अलग एंटीबॉडी होंठ द्वारा उत्पन्न प्रोफाइल 3-9 निदान, प्रतिजन 9 खोज के लिए उपयोगी है एक 10 उपचार, वैक्सीन की निगरानी के पाठ्यक्रम के बाद किया जाएगा और विशिष्ट रोग राज्यों के लिए और सामान्य में सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए व्यापक प्रभाव पड़ता है है.
Acknowledgments
इस शोध NIDCR के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HiSpeed Plasmid Midi KIt | Qiagen | 12643 | |
| 100 x 20 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985 | |
| FuGENE 6 | Roche Group | 1814443 | |
| Complete, Mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11836153001 | |
| Polypropylene 96 DeepWell 1 ml plate | Fisher Scientific | 12-566-120 | Deep well plate with lid and seal with Parafilm |
| Polypropylene microtiter plate | Fisher Scientific | 12-566-120 | |
| HTS Filter plate | EMD Millipore | MSBVN1B50 | |
| Ultralink Immobilized Protein A/G | Pierce, Thermo Scientific | 53133 (10ml) | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega Corp. | E2820 | For 2000 assays |
| Centro microplate luminometer | Berthold Technologies | LB 960 |
References
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