Summary
입술 (루시페라제 Immunoprecipitation 시스템)를 수행하는 기술적인 측면이 설명되어 있습니다. 전체 접근 방식은 포유 동물 세포에서 Renilla 루시페라제 (Ruc)에 융합 항원을 인코딩 키메라 유전자 표현이 포함됩니다. 원유 Ruc - 항원 추출물 다음 준비하고, 정화없이 항체를 정할 immunoprecipitation의 assays에 근무하고 있습니다.
Abstract
종합적 autoantigens 및 전염성 요원 항체 프로필을 이해하고 quantifying에 대한 기술은 질병 메커니즘에 새로운 통찰력을 얻을 수 있으며 다른 임상 특징과 질환 substratify 더 나은 pathogenesis을 이해하는 새로운 마커를 명료하게하다 수 있습니다. 우리는 매우 양적 방법 감염과 관련된 autoantigens 및 병원체 항원을 환자 세라의 항체 반응을 프로 파일링에 대한 루시페라제 Immunoprecipitation 시스템 (입술)라는 개발했습니다. ELISAs 달리, 매우 민감한 입술은 쉽게 보편적인 형식으로 다른 항원에 체액 serological 응답 프로파일을 조사하기 위해 구현 및 동적 항체 titer 6 로그온하는 최대 범위 생산합니다
Protocol
1. 도식 개요 :
이 동영상은 입술 분석을 수행에 관련된 단계를 설명합니다. 항원은 재조합 Renilla의 루시페라제 (Ruc) 항원 fusions, 그리고 원유 추출물로 Cos1 세포에 표현 취득하고 정화없이 사용. 입술 분석은 microtiter 우물에서 환자 세라와 크루드 전자 Ruc - 항원 추출물을 잠복기로 시작됩니다. 항체 - 항원 혼합물은 다음 IgG 분자를 캡처하는 단백질 A / G 비즈를 포함하는 96 - 웰 플레이트 필터로 전송됩니다. 단백질을 포함하고있는 필터 플레이트 세척 후 Ruc - 항원이 coelenterazine 기판 및 조명 장치의 추가에 의해 측정된다 바운드 A / G 구슬, 항체는 luminometer로 측정됩니다.
1 부 : Renilla - 항원 융합 단백질의 생산을위한 Plasmids의 Transfection
설정 : Cos1 세포가 표준 조직 문화 프로토콜을 사용하여 DMEM - 10% FCS에서 양식입니다. Renilla 루시페라제 fusions에 대한 Plasmids는 이전에 다음 ID로 한 설명했습니다. 이러한 plasmids에 대한 DNA는 Qiagen에서 Midiprep 키트를 사용하여 준비가되어 있습니다. 수율은 약 1 -3 MG해야합니다. -20 ° C.에서 1,000 μg / ML 주식 솔루션으로 DNA 농도 및 저장을 측정
절차 :
- 하루 전에 transfection, 분할 있으니까요 - 1 개의 새 항목 100 37 판과 부화 당 약 2 X 10 6 X 20mm 요리 ° C.에 세포
- 다음날, 왜냐하면 - 1 세포가 80~95% 합류한다. 각각의 플라스미드 DNA에 대한 레이블 1.5 ML의 폴리 프로필렌의 microfuge 튜브는 transfected 수 있습니다. 4 저장되어있는 FuGENE - 6 transfection 시약, ° C는, 적당한 온도로 워밍업 수 있습니다.
- 각 microfuge 튜브에 Opti - 멤 미디어의 94 μl를 추가합니다. 다음 측면 벽을 건드리지 않고도 Opti - 멤 미디어 FuGENE 6 개 중 6 μl를 추가합니다.
- 상온에서 5 분 혼합물을 품어.
- 1-2 Renilla 루시페라제 항원 융합에 대한 플라스미드의 μg (1mg/ml의 DNA 재고에서) 구조를 추가합니다. 혼합 후 실온에서 15 분 동안 혼합물을 품어.
- Cos1 세포의 미디어에 고르게 드리핑하여 세포에 DNA - FuGENE 6 Opti - 멤 솔루션을 전송합니다.
2 부 : 착취 Renilla - 항원 Fusions
- 이틀 transfection 후, 왜냐하면 - 1 세포가 수확됩니다. 이것은 미디어를 제거하고 PBS 6 ML과 세포 rinsing에 의해 시작됩니다. PBS를 decanting 후, 조직 문화 요리에서 잔여 PBS 멀리 피펫.
- 50 MM 트리스, 산도 7.5, 100 MM NaCl, 5 MM MgCl 2, 1 % 트리톤 X - 100, 50 % 글리세롤과 테아제 억제제 (50 ML 당 전체 miniprotease 억제제 칵테일 2 정제 구성된 차가운 용해 버퍼의 1.4 ML 추가 용해 버퍼). 휴대 scrapper로 수확 세포가 빠르게 얼음에 두 개의 1.5 ML의 microfuge 튜브 각 lysate의 절반을 전송할 수 있습니다.
- 브렌스 Sonifier 150 세포가 열려 휴식하는 데 사용됩니다. 각각, 2, 2, 4 sonication 설정으로 5 초, 5 초 5 초위한 얼음과 펄스에있는 세포 lysate를 포함하는 microcentrifuge 튜브를 놓습니다.
- 첫 번째 스핀 후, 부드럽게 튜브의 측벽에서 느슨하게 연결된 파편을 제거하기 위해 튜브를 반전 네 두 사분 돌지 ° C. 위해 12,500 RPM의 세포 lysate를 원심 분리기. 두 번째 스핀 후, 얼음에 새로운 microfuge 튜브에 두 튜브에서 펠렛을 방해하지 않고, 표면에 뜨는를 주의깊게 전송합니다.
- lysate의 μl 당 빛의 단위 (LU)를 계산합니다. LU를 측정하기 위해, 새로운 microfuge 튜브에 PBS 8 μl와 lysate 1 μl를 희석. 직접 희석 혼합에 1X coelenterazine 기판 100 μl를 추가하고 즉시 오초 읽을 수있는 튜브 luminometer을 (20분의 20 N 터너 과학)를 사용하여 튜브의 발광을 측정합니다.
- -80에서 aliquots의 시대의 긴 기간 1-2 일 또는 저장소에 대해 -20 ° C에서 Ruc - 항원 lysate를 저장 ° C.
3 부 : 세라 마스터 플레이트를 준비
- 첫번째 (50 MM 트리스, 산도 7.5, 100 MM NaCl, 5 MM MgCl 2, 1 % 트리톤 X - 100) 96 깊은 잘 폴리 프로필렌의 microtiter 플레이트의 각 잘하는 버퍼의 450 μl를 추가하여 세라 마스터 플레이트 만들기 . 이 단계에서, 염료, 페놀 레드는 또한 미래 세라 샘플 추가 및 입술 분석의 다른 단계를 모니터링을위한 추적 역할을 (최종 농도가 버퍼에서 0.2 μg / ML)을 버퍼에 포함될 수 있습니다.
- 다음 버퍼 A.의 450 μl를 포함하는 다른 우물 각 샘플에서 세라의 50 μl를 추가할 이것이 일반적으로 세라가 마스터 판의 마지막 두 우물에 추가되지 않습니다 버퍼 A.에서 세라의 1시 10분 희석 참고하기 때문에 이것은 버퍼 공백에 사용됩니다.
- 마스터 플레이트를 사용하기 전에, 그것은 광범위한 회전 플랫폼 (1~2시간) 흥분 상태입니다. 마스터 플레이트에 혈청 역입니다증발을 방지하기 위해 올바르게 저장 ° C의 경우 4 최소한 1 개월 (또는 이상)의 경.
- 아래에 설명한 바와 같이,이 마스터 플레이트 반복 여러 항원에 대항하는 세라의 프로파일 링을 위해 제거하는 희석 세라 10 μl를 제공합니다. 크고 작은 마스터 플레이트도 고용 수 있습니다. 그것이 사용되지 않는 Parafilm 잘 접시를 밀봉합니다.
4 부 : 입술 분석
- 폴리 프로필렌 96 - 얕은 잘 microtiter 접시는 세라를 테스트하는 데 사용됩니다. 첫 번째 단계에서, 8 채널 micropipette를 사용하여 96 - 웰 플레이트의 각 잘하기 위해 버퍼의 40 μl를 추가합니다.
- 다음 마스터 플레이트에서 희석 세라 (1 μl 세라 이에 상응하는 금액)의 10 μl를 타고 8 채널 micropipette를 사용하여 작업 판의 각 물론 직접 그것을 추가합니다.
- Ruc - 항원 추출물을 포함하는 마스터 믹스는 앞으로 1 X 10 7 빛의 단위 (LU)이 각각 잘하기 위해 버퍼의 50 μl에 추가됩니다 그러한 책정됩니다. 낮은 입력은 (같은 작은 X 10 6 1 등)도 사용하지만, 낮은 동적 범위의 결과하실 수 있습니다. 각 물론이 마스터 혼합 및 Ruc - 항원 혼합물의 피펫 50 μl를 확인합니다.
- 실온에서 1 시간 로터리 쉐이크에 번호판을 품어.
- 부화하는 동안, 새로운 96 잘 필터 HTS 접시 (Millipore, 베드 포드, MA) 각 우물의 바닥에 Ultralink 단백질 PBS에서 A / G 구슬 (피어스 생명 공학, 록퍼드, IL)의 30 % 정지 5 μl를 추가 .
- 1 시간 부화 후, 단백질 8 채널 micropipette를 사용하여 A / G 비즈를 포함한 96 웰 플레이트 필터 HTS에 100 μl Ruc - 항원 항체 반응 혼합물을 전송할 수 있습니다.
- 실온에서 1 시간 동안 추가 로터리 쉐이크에서 96 - 웰 플레이트 필터를 품어.
- 다음 진공 매니폴드에 필터 번호판을 씻으십시오. 각 잘는 PBS의 100 μl로 두 번 다음에, 버퍼 100 μl 8 번 씻어입니다. 이것은 수동으로 또는 로봇 pipetting 워크 스테이션과 함께 수행할 수 있습니다.
- 마지막 세척 후, 진공이 해제됩니다. 필터 플레이트를 제거하고 종이 타올이나 접시의 위쪽과 아래쪽에있는 수분을 제거해야하는 필터 종이 스택을 사용하여 건조 얼룩.
5 부 : 측정 및 데이터 분석 발광
설정 :
베르톨드의 LB 960 센트 microplate의 luminometer는 각 잘 단일 주입기를 사용하여 발광을 결정하는 데 사용됩니다. 기계가되면, 인젝터 세척주기를 사용하여 증류수 H 2 O와 주입기를 씻어. Coelenterazine 기판은 같은 제조 업체에서 설명한 Promega의 Renilla 기판 키트를 사용하여 준비가되어 있습니다. 1X coelenterazine 기판 믹스 일반적으로 6 ML (예 : 60 μl coelenterazine 주식 플러스 1X 버퍼 6 ML) 마중물 기계에 대비 한 전체 96 - 웰 플레이트를 실행합니다. 접시를 분석하기 전에 베르톨드의 LB 960 센트 microplate의 luminometer는 1X coelenterazine 기판과 함께 준비하는 것입니다. 기판을 주입하고 번호판을 읽기위한 설정을 포함하는 프로그램 파일을 엽니다. 이러한 측정, coelenterazine 기판의 50 μl를 주입, 접시는 발광의 읽기 5 초 뒤에 2 초에 대한 흥분 상태입니다.
- 플레이트 luminometer가 전체 번호판을 읽을 수있는 능력을 가지고 있지만, 접시의 일부 읽어도 (읽기 메뉴에서) 선택할 수 있습니다. 접시의 읽기 시작 프로그램을 시작합니다.
- 실행 후, luminometer에 spillage을 방지하기 위해 즉시 microtiter 필터 플레이트를 제거합니다. 분석을위한 Excel 형식으로 MikroWin 프로그램 생성된 데이터를 내보낼 수 있습니다.
- 우리는 두 개의 독립적인 실행에서 세라를 평가하는 것이 좋습니다. 데이터는 다음 각 샘플에 대한 LU의 titer 값을 생성하기 위해 평균입니다. 이러한 값은 더욱 버퍼 공백을 뺄 조정할 수 있습니다.
- 같은 컷오프이 말은 플러스의 컨트롤 값을 3 또는 5 표준 편차를 취하여 계산 수있는 결정과 같은 추가 데이터 분석.
Discussion
입술은 최소한의 분석 최적화 및 그 단순 때문에, 고품질의 데이터는 일반적으로 특정 항원에 대한 이주 아래의 입술을 사용하여 생성할 수 있어야합니다. 가장 시간이 많이 걸리는 단계는 복제되고 Ruc - 항원 융합을 포함하는 적절한 플라스미드 발현 벡터를 생성. 이러한 plasmids가 생성되면 위에서 설명한 바와 같이, 하나 또는 여러 개의 항원이 빠르게 입술로 테스트할 수 있습니다. 그것은 입술은 세라도 튜브 형식이나 또는 BIOMEK 로봇 스테이션 2 또는 진공 여과와 함께 접시 세척기의 도움 microtiter 접시에 필터를 테스트 할 수있는 등 매우 다양한 것을 주목하여야한다. 이것은 확장성이 높은 시스템은 인간 autoantigens 3 또는 바이러스 4 전체 프로테옴의 패널의 프로 파일링 병렬 입술 있습니다. 그것은 입술로 생성된 다양한 항체 프로필 치료 10, 백신 모니터링 과정 다음, 진단 3-9, 항원 발견 9 유용하게 사용될 가능성이 높습니다 및 특정 질병 상태와 일반적으로 공중 보건에 대한 광범위한 의미가 있습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIDCR의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HiSpeed Plasmid Midi KIt | Qiagen | 12643 | |
| 100 x 20 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985 | |
| FuGENE 6 | Roche Group | 1814443 | |
| Complete, Mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11836153001 | |
| Polypropylene 96 DeepWell 1 ml plate | Fisher Scientific | 12-566-120 | Deep well plate with lid and seal with Parafilm |
| Polypropylene microtiter plate | Fisher Scientific | 12-566-120 | |
| HTS Filter plate | EMD Millipore | MSBVN1B50 | |
| Ultralink Immobilized Protein A/G | Pierce, Thermo Scientific | 53133 (10ml) | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega Corp. | E2820 | For 2000 assays |
| Centro microplate luminometer | Berthold Technologies | LB 960 |
References
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