Summary
Os aspectos técnicos do desempenho LIPS (Sistemas de imunoprecipitação luciferase) são descritos. A abordagem global envolve expressar genes quiméricos codificando antígenos fundido a Renilla luciferase (Ruc) em células de mamíferos. Crude Ruc-antígeno extratos são então preparadas e, sem a purificação, empregada em ensaios de imunoprecipitação para quantificar anticorpos.
Abstract
Tecnologias para a compreensão abrangente e quantificar perfis de anticorpos para auto-antígenos e agentes infecciosos podem gerar novos insights sobre os mecanismos da doença e pode elucidar novos marcadores para substratify doença com diferentes características clínicas e entender melhor a patogênese. Nós desenvolvemos um método altamente quantitativa denominada luciferase Sistemas de imunoprecipitação (LIPS) para perfis respostas de anticorpos do paciente soros para auto-antígenos e antígenos de patógenos associados à infecção. Ao contrário dos ELISAs, o LIPS altamente sensível é facilmente implementada para pesquisa humoral perfis de resposta sorológica a antígenos diferentes em um formato universal e produz títulos de anticorpos dinâmica varia até 6 log
Protocol
1. Visão geral esquemática:
Este vídeo mostra os passos envolvidos na realização do ensaio LIPS. Antígenos são expressos em células como Cos1 recombinante luciferase Renilla (Ruc) antigénio de fusões e extratos são obtidos e utilizados sem purificação. O ensaio LIPS é iniciada através da incubação crud e Ruc antígeno extratos com o soro do paciente em poços da microplaca. A mistura antígeno-anticorpo é então transferido para uma placa de 96 poços de filtro contendo proteína A / G grânulos para capturar moléculas de IgG. Depois de lavar a placa de filtro contendo a proteína Um anticorpo / G contas, ligado Ruc antígeno é medida pela adição de substrato celenterazina e unidades de luz são medidos com um luminómetro.
PARTE 1: transfecção de plasmídeos para a produção de proteínas Renilla Antígeno-Fusion
Set-up: Cos1 células são cultivadas em DMEM FCS-10%, utilizando protocolos padrão da cultura de tecidos. Plasmídeos para Renilla fusões luciferase tem sido descrito anteriormente 1. DNA para estes plasmídeos é preparado usando um kit da Qiagen Midiprep. O rendimento deve ser de aproximadamente 1 mg -3. Medir a concentração de DNA e armazenada como um mg 1000 / ml de solução a -20 ° C.
Procedimento:
- Um dia antes de dividir transfecção, Cos-1 células em novo 100 x 20 mm em pratos de cerca de 2 X 10 6 por placa e incubar a 37 ° C.
- No dia seguinte, o Cos-1 células deve ser 80-95% confluentes. Rótulo 1,5 ml tubos de polipropileno de microcentrífuga para cada DNA plasmídeo a ser transfectadas. Permitir que o reagente de transfecção FuGENE-6, que é armazenado a 4 ° C, para aquecer a temperatura ambiente.
- Adicionar 94 mL de Opti-MEM mídia para cada tubo de microcentrífuga. Em seguida adicionar 6 mL de FuGENE 6 a mídia Opti-MEM sem tocar na parede lateral.
- Incubar a mistura por 5 minutos em temperatura ambiente.
- Adicione 1-2 mg (1mg/ml de ações DNA) de plasmídeo para a fusão do antígeno Renilla luciferase construir. Misturar e incubar a mistura por 15 minutos em temperatura ambiente.
- Transferir o DNA FuGENE solução 6-Opti-MEM para as células por gotejamento é uniforme na mídia do Cos1 células.
PARTE 2: A colheita Renilla antígeno-Fusions
- Dois dias após a transfecção, o Cos-1 as células são colhidas. Este é iniciado pela remoção da mídia e, em seguida, enxaguar as células com 6 ml de PBS. Após decantação da PBS, pipeta fora qualquer PBS residual do prato de cultura de tecidos.
- Adicionar 1,4 ml de tampão de lise fria composta por 50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1% Triton X-100 glicerol, 50% e os inibidores da protease (2 comprimidos de coquetel completo miniprotease inibidor por 50 ml de tampão de lise). Células da colheita com uma scrapper de células e rápida de transferir metade do lisado de cada um dos dois tubos de 1,5 ml de microcentrífuga no gelo.
- A Sonifier Branson 150 é usado para quebrar as células abertas. Coloque o tubo de microcentrífuga contendo o lisado celular no gelo e pulso durante 5 segundos, 5 segundos e 5 segundos com as configurações de sonicação de 2, 2 e 4, respectivamente.
- Centrifugar o lisado celular a 12.500 RPM por duas rodadas 4 minutos a 4 ° C. Após a rodada em primeiro lugar, inverter cuidadosamente os tubos para remover os detritos frouxamente ligados a partir da parede lateral do tubo. Após a rodada em segundo lugar, transferir cuidadosamente o sobrenadante, sem perturbar o sedimento, a partir dos dois tubos para um tubo de microcentrífuga novo no gelo.
- Cálculo das unidades de luz (CN) por mL de lisado. Para medir o LU, diluir 1 ml de lisado com 8 mL de PBS em um tubo de microcentrífuga novo. Adicionar diretamente os 100 l do substrato 1X celenterazina à mistura diluída e imediatamente luminescência medida no tubo com um luminômetro tubo (20/20 n Turner Scientific) com uma leitura de 5 segundos.
- Armazenar o lisado Ruc antígeno a -20 ° C por 1-2 dias ou armazenar por longo período de tempo em alíquotas a -80 ° C.
PARTE 3: Preparar uma Sera Placa Mestre
- Fazer um prato principal sera primeiramente adicionando 450 mL de tampão A (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1% Triton X-100) em cada poço de uma microplaca de 96 poços profundos de polipropileno . Nesta etapa, a Red, corante Fenol, também podem ser incluídos em tampão A (concentração final é de 0,2 mg / ml em Tampão A) para atuar como um traçador para o monitoramento da adição da amostra futuro soros e outras medidas do ensaio LIPS.
- Em seguida adicione 50 ul de soro de cada amostra aos diferentes poços contendo 450 mL de tampão A. Note que este é uma diluição de 1:10 dos soros em tampão A. Tipicamente soros não é adicionado aos dois últimos poços da placa de mestre, pois este é reservado para os espaços em branco buffer.
- Antes de usar a placa de mestre, ele é amplamente abalado (1-2 horas) em uma plataforma rotador. O soro no prato principal é stasável por pelo menos 1 mês (ou mais) a 4 ° C, se armazenados corretamente para evitar a evaporação.
- Como descrito abaixo, esta placa mestre fornece 10 ml de soro diluído para ser repetidamente removido para o perfil dos soros contra antígenos múltiplos. Mestre placas maiores e menores também podem ser empregadas. Selar a placa bem com Parafilm quando não estiver sendo usado.
PARTE 4: ensaio LIPS
- Polipropileno de 96 placas de microtitulação bem rasas são usados para testar soros. Na primeira etapa, adicionar 40 mL de tampão A para cada poço da placa de 96 poços usando uma micropipeta de 8 canais.
- Em seguida, pegue 10 ml de soro diluído (1 equivalente soros mL) a partir da placa principal e adicioná-lo diretamente a cada poço da placa de trabalho usando uma micropipeta de 8 canais.
- Um mix master contendo o extrato Ruc antígeno é o próximo formulado tal que 1 X 10 7 unidades de luz (LU) é adicionado em 50 mL de tampão A para cada poço. Entradas mais baixas (menos de 1 X 10 6) também pode ser usado, mas resultam em um menor intervalo dinâmico. Faça esta mistura mestre e pipeta mL 50 de Ruc antígeno-mistura para cada poço.
- Incubar a placa em um agitador rotativo por 1 hora à temperatura ambiente.
- Durante a incubação, adicionar 5 mL de uma suspensão de 30% do ULTRALINK proteína A / G contas (Pierce Biotecnologia, Rockford, IL) em PBS para o fundo de cada poço de uma nova de 96 poços filtro de placa HTS (Millipore, Bedford, MA) .
- Após a incubação de 1 hora, transferir a 100 l Ruc antígeno-anticorpo mistura de reação para 96 placas de filtro bem HTS contendo a proteína A / G contas usando uma micropipeta de 8 canais.
- Incubar a placa de 96 poços filtro em um agitador rotativo por 1 hora em temperatura ambiente.
- De seguida, lavar a placa de filtro em um distribuidor de vácuo. Cada poço é lavado oito vezes com 100 ul de tampão A, seguido por duas vezes com 100 ul de PBS. Isto pode ser feito manualmente ou com uma estação de trabalho de pipetagem robótico.
- Após a última lavagem, o vácuo é desligado. Remova a placa de filtro e secar secar utilizando uma pilha de toalhas de papel ou papel-filtro certificando-se de remover a umidade na parte superior e inferior da placa.
PARTE 5: Medição de análise de dados e Luminescência
Set-up:
A LB Berthold 960 Centro luminômetro é usado para determinar a luminescência em cada cavidade utilizando um injector único. Uma vez que a máquina está ligada, lavar o injetor com H 2 O destilada usando o ciclo de lavagem injector. Celenterazina substrato é preparado usando o kit Promega substrato Renilla como descrito pelo fabricante. Tipicamente ml 6 de mix 1X celenterazina substrato (ou seja, 60 mL de ações celenterazina mais 6 ml de 1X tampão) está preparada para aprontar a máquina e executando um prato cheio de 96 poços. Antes de analisar a placa, o LB Berthold 960 Centro luminômetro é preparado com 1X substrato celenterazina. Abrir um arquivo de programa que contém a definição para injetar o substrato e leitura da placa. Para estas medições, 50 ul de substrato celenterazina é injetado, a placa é abalada por 2 segundos, seguido por um 5 segundos de leitura de luminescência.
- Embora o luminômetro placa tem a capacidade de ler a placa inteira, uma leitura parcial da placa também pode ser selecionada (no menu de leitura). Iniciar o programa, que inicia a leitura da placa.
- Após a corrida, retire a placa de filtro de microtitulação prontamente para impedir derrame para o luminômetro. Exportar os dados gerados com o programa MikroWin em um formato Excel para análise.
- Recomendamos avaliar a soros de duas corridas independentes. Dados é, então, em média, para gerar os valores LU título para cada amostra. Estes valores podem ainda ser ajustado para subtrair os espaços em branco buffer.
- Análise de dados adicionais, como determinar o corte pode ser calculada tomando a média mais 3 ou 5 desvios-padrão dos valores de controle.
Discussion
LIPS requer otimização de ensaio mínima e, devido à sua simplicidade, dados de alta qualidade pode ser tipicamente gerados usando LIPS em menos de duas semanas para qualquer dado antígeno. Os passos mais demorados são a clonagem e gerando o vetor de expressão apropriada plasmídeo contendo o antígeno de fusão Ruc. Uma vez que esses plasmídeos são gerados, antígenos únicos ou múltiplos podem ser rapidamente testado com LIPS como descrito acima. Deve-se observar que os lábios é bastante versátil de modo que sera também pode ser testada em um formato de tubo ou, alternativamente, em uma placa de microtitulação de filtro com o auxílio de uma estação de trabalho robótico BIOMEK 2 ou uma máquina de lavar prato com filtração a vácuo. Este sistema altamente escalável permite a LIPS paralelo perfil de um painel de auto-antígenos humanos 3 ou o proteoma inteiro de um vírus 4. É provável que muitos perfis diferentes de anticorpos gerados por LIPS será útil para o diagnóstico 3-9, antígeno descoberta 9, seguindo o curso do tratamento 10, o monitoramento da vacina e tem amplas implicações para os estados de doença específica e para a saúde pública em geral.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIDCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HiSpeed Plasmid Midi KIt | Qiagen | 12643 | |
| 100 x 20 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985 | |
| FuGENE 6 | Roche Group | 1814443 | |
| Complete, Mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11836153001 | |
| Polypropylene 96 DeepWell 1 ml plate | Fisher Scientific | 12-566-120 | Deep well plate with lid and seal with Parafilm |
| Polypropylene microtiter plate | Fisher Scientific | 12-566-120 | |
| HTS Filter plate | EMD Millipore | MSBVN1B50 | |
| Ultralink Immobilized Protein A/G | Pierce, Thermo Scientific | 53133 (10ml) | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega Corp. | E2820 | For 2000 assays |
| Centro microplate luminometer | Berthold Technologies | LB 960 |
References
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- Burbelo, P. D., Leahy, H. P., Iadarola, M. J., Nutman, T. B. A Four-Antigen Mixture for Rapid Assessment of Onchocerca volvulus Infection. PLoS Negl Trop Dis. 3, e438-e438 (2009).
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