Summary
Технические аспекты выполнения LIPS (люциферазы Системы Иммунопреципитация) описаны. Общий подход предполагает выражения химерных генов, кодирующих антигены, слитый с Renilla люциферазы (ККО) в клетках млекопитающих. Сырая Ruc-антиген экстракты затем подготовили и, без очистки, занятых в иммунопреципитации анализов количественного антител.
Abstract
Технологии для всестороннего понимания и количественного антител профилей для аутоантигенов и инфекционные агенты могут привести к новому пониманию механизмов болезни и, возможно, выяснить новые маркеры, чтобы substratify заболевания с различными клиническими признаками и лучше понять патогенез. Мы разработали очень количественный метод, называемый люциферазы Системы Иммунопреципитация (LIP) для профилирования пациента антител сыворотки ответы на аутоантигенов и патогенных антигенов, связанных с инфекцией. В отличие от ИФА, очень чувствительны LIPS легко реализуется для обследования гуморального серологических профилей ответ на различные антигены, в универсальный формат и производит динамическое титра антител в диапазоне до 6 журналов
Protocol
1. Схема Обзор:
Это видео демонстрирует этапы выполнения LIPS анализа. Антигены выражаются в Cos1 клеток рекомбинантных люциферазы Renilla (ККО)-антиген слияний и сырой экстрактов, полученных и использованных без очистки. LIPS анализ проводится по инициативе инкубации падла электронной Ruc-антиген экстрактов с пациентом сывороток в лунки. Антитело-антиген смесь затем переведен в 96-луночного фильтр пластины, содержащей белок / G бисером, чтобы захватить IgG молекулы. После мытья фильтра пластины, содержащей белок / G бусы, антитела связаны Ruc-антиген измеряется добавлением субстрата coelenterazine и световых единицах измеряют люминометра.
ЧАСТЬ 1: Трансфекция плазмиды для производства Renilla-антиген Белки Fusion
Настройка: Cos1 клетки культивируют в DMEM-10% FCS с помощью стандартных протоколов культуры ткани. Плазмиды для Renilla люциферазы слияния были описаны ранее 1. ДНК этих плазмид которая подготовлена с применением комплекта Midiprep от Qiagen. Выход должен быть примерно 1 -3 мг. Измерить концентрацию ДНК и хранить 1000 мкг / мл раствора акции при температуре -20 ° C.
Порядок действий:
- За день до трансфекции, сплит COS-1 клеток в новую 100 х 20 мм блюда примерно 2 х 10 6 на чашку и инкубировать при температуре 37 ° C.
- На следующий день, COS-1 клетках должна быть 80-95% вырожденная. Этикетка 1,5 мл полипропиленовые трубы микроцентрифужную для каждой плазмидной ДНК для трансфекции. Разрешить FuGENE-6 трансфекции реагента, который хранится при температуре 4 ° С, чтобы нагреть до комнатной температуры.
- Добавить 94 мкл Opti-MEM СМИ, чтобы каждый микроцентрифужную трубки. Затем добавьте 6 мкл FuGENE 6 до Opti-MEM средств массовой информации, не прикасаясь к боковой стенке.
- Выдержите смесь в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Добавьте 1-2 мкг (со склада ДНК 1mg/ml) плазмиды для Renilla люциферазы слияние антиген конструкции. Смешать и инкубировать затем смесь в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Передача ДНК-FuGENE 6-Opti-MEM решение клеток капала его равномерно в СМИ Cos1 клеток.
ЧАСТЬ 2: Уборочная Renilla-антиген Слияния
- Через два дня после трансфекции, Cos-1 клетки собирают. Это инициировано удаление средств массовой информации и последующей промывкой клеток с 6 мл PBS. После декантации PBS, пипетки от любой остаточной PBS от блюдо культуры ткани.
- Добавить 1,4 мл холодного буфера для лизиса состоит из 50 мМ Трис, рН 7,5, 100 мМ NaCl, 5 мМ MgCl 2, 1% Тритон Х-100, 50% глицерина и ингибиторы протеазы (2 таблетки полных коктейль ингибиторов miniprotease на 50 мл лизис буфера). Урожай клетки с клеткой забияка и быстро передавать половине лизат к каждому из двух пробирки на 1,5 мл микроцентрифужную на льду.
- Брэнсон Sonifier 150 используется для разрушить открытые клетки. Место микроцентрифужных пробирку Клеточный лизат на льду и пульс в течение 5 сек, 5 сек и 5 сек с ультразвуком настройки 2, 2 и 4, соответственно.
- Центрифуга Клеточный лизат при 12500 оборотов в течение двух 4 минуты спинов при 4 ° C. После первого спина, аккуратно переверните труб для удаления свободно прилагается мусора с боковой стенке трубы. После повторного запуска, тщательно передачи супернатант, не нарушая гранулы, из двух труб в новую пробирку микроцентрифужную на льду.
- Рассчитать световых единицах (LU) за мкл лизата. Для измерения LU, развести 1 мкл лизата с 8 мкл PBS в новую пробирку и отцентрифугировать. Непосредственно добавить 100 мкл 1X coelenterazine субстрата смесь разбавляется и сразу же мерой свечения в трубке использованием трубки люминометра (20/20 н Тернер Scientific) с 5-секундным читать.
- Магазин Ruc-антиген лизат при температуре -20 ° С в течение 1-2 дней или хранить в течение длительного периода раз в аликвоты при -80 ° C.
ЧАСТЬ 3: Подготовка пластины Сера Мастер
- Сделать пластины сыворотки мастер, добавьте сначала 450 мкл буфера (50 мМ Трис, рН 7,5, 100 мМ NaCl, 5 мМ MgCl 2, 1% Тритон Х-100) в каждую лунку 96-артезианской планшет полипропилена . На данном этапе, красителей, фенола красного, также могут быть включены в буфере (конечная концентрация составляет 0,2 мкг / мл в буфере), чтобы действовать в качестве индикатора для мониторинга будущих образцов сыворотки сложение и другие этапы анализа губы.
- Затем добавьте 50 мкл сыворотки от каждого образца для различных скважин содержащие 450 мкл буфера А. Заметим, что это 1:10 разведения сывороток в буфере А. Обычно сыворотки не добавляется в последних двух скважин мастера пластины, поскольку это зарезервировано для буфера пробелами.
- Перед тем как использовать мастер пластину, она широко потрясен (1-2 часов) по ротатор платформы. Сыворотки в мастер пластины устойчивоответственные за не менее 1 месяца (или больше) при 4 ° С, при хранении правильно, чтобы предотвратить испарение.
- Как описано ниже, то эта табличка мастер обеспечивает 10 мкл разведенной сыворотки, чтобы быть повторно снять для профилирования сыворотки против нескольких антигенов. Большие и меньшие пластины мастер может также использоваться. Печать пластины хорошо с парафильмом, когда он не используется.
ЧАСТЬ 4: губы анализа
- Полипропилен 96-мелкой луночный микропланшет используются для тестирования сывороток. На первом этапе, добавить 40 мкл буфера в каждую лунку 96-луночного планшета использованием 8-канальный микропипетки.
- Затем возьмите 10 мкл разведенной сыворотки (1 мкл сыворотки эквивалент) с мастером тарелку и добавить его прямо в каждую лунку рабочей пластины с использованием 8-канальный микропипетки.
- Мастер смесь, содержащая Ruc-антиген экстракта следующего сформулированы так, что 1 X 10 7 световых единицах (LU) добавляется в 50 мкл буфера в каждую лунку. Нижние входы (всего 1 X 10 6) также может быть использован, но приведет к снижению динамического диапазона. Сделать эту смесь мастер и пипеткой 50 мкл Ruc-антиген смеси в каждую лунку.
- Инкубируйте планшет на роторном шейкере в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Во время инкубации, добавляют 5 мкл 30% суспензии Ultralink белка / G шариков (Пирс биотехнологии, Рокфорд, штат Иллинойс) в PBS на дно каждой лунки новой 96-фильтра HTS пластины (Millipore, Bedford, MA) .
- После 1 часа инкубации, передачи 100 мкл Ruc антиген-антитело реакционной смеси до 96 и фильтром HTS чашки, содержащие белок / G бисером использованием 8-канальный микропипетки.
- Инкубируйте 96-луночного фильтра пластина на ротационном шейкере в течение 1 дополнительный час при комнатной температуре.
- Следующая промывки фильтра пластина на вакуумный коллектор. Каждая скважина промывается в 8 раз с 100 мкл буфера, а затем два раза по 100 мкл PBS. Это можно сделать вручную или с помощью роботов станции пипетки.
- После последней стирки, вакуум отключается. Снимите фильтр пластины и промокните насухо с помощью стека бумажных полотенец или фильтровальную бумагу убедившись, что для удаления влаги на верхней и нижней части пластины.
ЧАСТЬ 5: Измерение люминесценции и анализ данных
Настройка:
Л. Б. Бертольд 960 Centro микропланшет люминометра используется для определения люминесценции в каждую лунку с помощью одной форсунки. Как только машина включена, промыть инжектор дистиллированной H 2 O использованием цикла инжектор мыть. Coelenterazine субстрат подготовлен с использованием подложки Promega Renilla комплект, как описано производителем. Как правило 6 мл 1X смесь субстрата coelenterazine (т.е. 60 мкл фондовом coelenterazine плюс 6 мл 1X буфера) получают для грунтования машину и работает на один полный 96-луночного планшета. Прежде чем анализировать пластины, Л. Б. Бертольд 960 Centro микропланшет люминометра грунтуется с 1X coelenterazine подложки. Открытые программы файл, содержащий настройки для потребителей инъекционных подложки и чтения пластины. Для этих измерений, 50 мкл coelenterazine субстрат вводят внутривенно, пластины встряхивают в течение 2 секунд, затем 5 секунд прочитать люминесценции.
- Хотя пластинка люминометра имеет возможность прочитать всю пластинку, частичное читать пластины также могут быть выбраны (под чтение меню). Запустите программу, которая инициирует чтение пластины.
- После запуска, снимите планшет фильтр быстро, чтобы предотвратить утечку люминометра. Экспорт данных, полученных с программой MikroWin в формате Excel для анализа.
- Мы рекомендуем оценки сыворотки от двух независимых работает. Данные усреднены для получения значений LU титр для каждого образца. Эти значения могут быть скорректированы дальнейшие вычесть буфера пробелами.
- Дополнительный анализ данных, таких как определение отсечки может быть рассчитана путем вычитания из средней плюс 3 или 5 стандартных отклонений от контрольных значений.
Discussion
LIPS требует минимальной оптимизации анализа и, благодаря своей простоте, данные высокого качества как правило, могут быть созданы с помощью LIPS в возрасте до двух недель для любого данного антигена. Наиболее трудоемким шаги клонирования и создания соответствующей плазмиды вектор выражение, содержащее Ruc-антиген синтеза. После того как эти плазмиды генерируются, один или несколько антигенов могут быть быстро протестированы с губами, как описано выше. Следует отметить, что губы достаточно универсальным, что сыворотку можно также проверить в трубке формате или же на микротитровальных фильтр пластины с помощью робота Biomek рабочей станции 2 или пластина шайбы с вакуумной фильтрации. Это масштабируемая система позволяет параллельно LIPS профилирования панели человеческих аутоантигенов 3 или целые протеома вируса 4. Вполне вероятно, что многие различные профили антител порожденных губы будут полезны для диагностики 3-9, антиген открытие 9, после курса лечения 10, вакцина мониторинга и имеет широкие последствия для конкретных болезненных состояний, и для общественного здоровья в целом.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Внутренние программы исследований NIDCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HiSpeed Plasmid Midi KIt | Qiagen | 12643 | |
| 100 x 20 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985 | |
| FuGENE 6 | Roche Group | 1814443 | |
| Complete, Mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11836153001 | |
| Polypropylene 96 DeepWell 1 ml plate | Fisher Scientific | 12-566-120 | Deep well plate with lid and seal with Parafilm |
| Polypropylene microtiter plate | Fisher Scientific | 12-566-120 | |
| HTS Filter plate | EMD Millipore | MSBVN1B50 | |
| Ultralink Immobilized Protein A/G | Pierce, Thermo Scientific | 53133 (10ml) | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega Corp. | E2820 | For 2000 assays |
| Centro microplate luminometer | Berthold Technologies | LB 960 |
References
- Burbelo, P. D., Goldman, R., Mattson, T. L. A simplified immunoprecipitation method for quantitatively measuring antibody responses in clinical sera samples by using mammalian-produced Renilla luciferase-antigen fusion proteins. BMC Biotechnol. 5, 22-22 (2005).
- Burbelo, P. D., Leahy, H. P., Iadarola, M. J., Nutman, T. B. A Four-Antigen Mixture for Rapid Assessment of Onchocerca volvulus Infection. PLoS Negl Trop Dis. 3, e438-e438 (2009).
- Burbelo, P. D. Sensitive and robust luminescent profiling of anti-La and other autoantibodies in Sj gren’s syndrome. Autoimmunity. 139, 241-245 (2009).
- Burbelo, P. D. Rapid antibody quantification and generation of whole proteome antibody response profiles using LIPS (luciferase immunoprecipitation systems). Biochem Biophys Res Commun. 352, 889-895 (2007).
- Burbelo, P. D., Groot, S., Dalakas, M. C., Iadarola, M. J. High definition profiling of autoantibodies to glutamic acid decarboxylases GAD65/GAD67 in stiff-person syndrome. Biochem Biophys Res Commun. 366, 1-7 (2008).
- Burbelo, P. D. A new luminescence assay for autoantibodies to mammalian cell-prepared insulinoma-associated protein 2. Diabetes Care. 31, 1824-1826 (2008).
- Burbelo, P. D. Serological diagnosis of human herpes simplex virus type 1 and 2 infections by luciferase immunoprecipitation system assay. Clin Vaccine Immunol. 16, 366-371 (2009).
- Burbelo, P. D. Highly quantitative serological detection of anti-cytomegalovirus (CMV) antibodies. Virol J. 6, 45-45 (2009).
- Burbelo, P. D. Four-antigen mixture containing v-cyclin for serological screening of human herpesvirus 8 infection. Clin Vaccine Immunol. 16, 621-627 (2009).
- Ramanathan, R. A luciferase immunoprecipitation systems assay enhances the sensitivity and specificity of diagnosis of Strongyloides stercoralis infection. J Infect Dis. 198, 444-451 (2008).
