Summary
Wir zeigen das Protokoll für die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Lentivirus-vermittelte Lieferung der menschlichen Faktoren Oct4, Sox2, Nanog und Lin28. Pluripotenz von Morphologie und die Anwesenheit von embryonalen Stammzellen (ES) Zell-spezifische Marker bestätigt.
Abstract
Im Jahr 2006 Yamanaka und seine Kollegen zunächst nach, dass Retrovirus-vermittelte Lieferung und die Expression von Oct4, Sox2, c-Myc und Klf4 induzieren können die pluripotenten Zustand in Maus-Fibroblasten ist. 1 Die gleiche Gruppe berichtete auch die erfolgreiche Reprogrammierung von menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) unter Verwendung von humanen Versionen des gleichen Transkriptionsfaktoren, die durch retrovirale Vektoren geliefert. 2 Zusätzlich berichtete James Thomson et al., dass die Lentivirus-vermittelte Co-Expression von einem anderen Satz von Faktoren (Oct4, Sox2, Nanog und Lin28 ) war in der Lage Reprogrammierung menschlicher Körperzellen in iPS-Zellen. 3
iPS-Zellen ähneln embryonalen Stammzellen in der Morphologie, Proliferation und die Fähigkeit, sich in alle Gewebetypen des Körpers differenzieren. Menschliche iPS-Zellen haben einen entscheidenden Vorteil gegenüber embryonalen Stammzellen, da sie wichtige Eigenschaften von ES-Zellen ohne das ethische Dilemma der Embryo zerstört aufweisen. Die Erzeugung von Patienten-spezifischen iPS-Zellen umgeht eine wichtige Hürde, um persönliche regenerativen Medizin Therapien durch den Wegfall der Potenzial für Immunabwehr von nicht-autologen transplantierten Zellen.
Hier zeigen wir das Protokoll für die Reprogrammierung menschlicher Fibroblasten-Zellen unter Verwendung des Stemgent Menschliche TF Lentivirus Set. Wir zeigen auch, dass Zellen mit diesem Satz neu programmiert, um iPS zeigen Morphologie vier Tage nach der Transduktion beginnen. Mit dem Stemolecule Y27632, wählten wir für iPS-Zellen und beobachtet richtige Morphologie nach drei aufeinanderfolgenden Runden Kolonie Kommissionierung und Passagieren. Wir zeigen auch, dass nach der Neuprogrammierung Zellen der Pluripotenz-Marker AP, Oberflächenmarker TRA-1 bis 81, TRA-1 bis 60, SECO-4 und SSEA-3, und nukleare Marker Oct4, Sox2 und Nanog angezeigt.
Protocol
1. Reprogrammierung
- Seed BJ-Zellen bei einer Dichte von 1 x 10 5 Zellen pro Vertiefung einer 6-Well-Platte. Kultur die Zellen in 2 ml Wachstumsmedium (450 ml EMEM mit 50 ml ES qualifizierten FBS, 5 ml 10 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 5 ml Penicillin / Streptomycin, 5 ml 200 mM L-Glutamin und 0,9 ml 55 mM β ergänzt -Mercaptoethanol) über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Am selben Tag, beginnt die Vorbereitung MEF Feeder-Platten durch Zugabe von 0,1% Gelatine in Wasser zu einer 6-Well Platte verdünnt und Inkubation über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Nach der Inkubation zu entfernen Medium aus dem BJ-Zellen und 2 ml Wachstumsmedium mit 6 pg / ml Polybren ergänzt, 500 ul hOct4-Lentivirus, 50 ul hSox2-Lentivirus, 50 ul hNanog-Lentivirus und 50 ul hLin28-Lentivirus in jede Vertiefung . Schütteln Sie die Platte, um eine gleichmäßige Beschichtung des Mediums zu gewährleisten. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Am selben Tag, entfernen Sie 1 Flasche CF-1 MEF-Zellen aus flüssigem Stickstoff und Auftauen. Entfernen von Flüssigkeit aus der Gelatine beschichteten Vertiefungen (siehe Schritt 1.2) und fügen MEF Feeder-Zellen bei einer Dichte von 0,2 x 10 5 Zellen / well. Das Gesamtvolumen pro Vertiefung sollte 2ml Zellen in MEF Wachstumsmedium (450 ml DMEM, ergänzt mit 50 ml FBS und 5 ml nicht-essentielle Aminosäuren).
- Am nächsten Tag lösen BJ-Zellen mit 0,05% Trypsin / EDTA und Zentrifuge bei 200 xg für 5 Minuten. Saugen Sie das Medium und Zellen in Wachstumsmedium. Entfernen Sie Medium von der MEF Feeder-Platte (siehe Schritt 1,4) und 2 ml / well des BJ Zellsuspension. Die Konzentration der Zellen sollte ca. 5 x 10 4 Zellen / well werden. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Ersetzen Medium 24 Stunden nach der erneuten Aussaat mit menschlichen ES / iPS Zellkulturmedium (400 ml DMEM/F12 mit 100 ml Knockout Serum Replacement, 5 ml 10 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 5 ml 200 mM L-Glutamin, 0,9 ml ergänzt 55 mM β-Mercaptoethanol und 20 ng / ml humanes rekombinantes bFGF). Ändern Medium alle 24 Stunden für 7 Tage.
- Nach sieben Tagen ändern mittel-bis MEF konditionierten Medium (siehe Abschnitt 2).
2. Vorbereitung der MEF konditioniertem Medium
- Seed CF-1 MEF Feeder-Zellen bei 2 x 10 5 Zellen / well auf einer 6-Well-Platte in 2 ml MEF Wachstumsmedium. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Ändern Medium für die menschliche ES / iPS Zellkulturmedium. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Sammeln Überstand alle 24 Stunden für vier Tage. Den Überstand durch ein 0,22 um-Filter.
- Supplement Überstand mit 50 ng / ml bFGF.
3. iPS Colony Auswahl und Passagierung
- Wählen Sie ein ES-ähnliche Kolonie und re-Samen in menschlichen ES / iPS Kulturmedium mit 10 uM Stemolecule Y27632 auf Zellkulturschalen mit CF-1 MEF Feeder-Zellen vor ausgesät ergänzt. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Ändern Sie das Kulturmedium alle 24 Stunden für die ersten 7 Tage (ohne Ergänzung mit Stemolecule Y27632). Nach sieben Tagen ändern mittel-bis MEF konditionierten Medium (siehe Abschnitt 2 für die Vorbereitung). Wir setzten die Passage der Zellen, bis sie typischen menschlichen ES Morphologie zeigten.
4. Immunzytochemische Untersuchung der Pluripotenz Markers
- Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS.
- Fix die Zellen mit 500 ul Fixativ für 20 Minuten bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS.
- Block unspezifische Bindung mit 500 ul Blockierungspuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Sie die Zellen mit 250 ul der spezifischen Primärantikörper über Nacht bei 4 ° C (wir TRA-1 bis 81, TRA-1 bis 60, SSEA-4, SECO-3, Oct4, Sox2, Nanog und Lin28 bei 1:100 Verdünnungen).
- Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS.
- Inkubieren Sie die Zellen mit 250 ul des sekundären Antikörper für 1 Stunde bei Raumtemperatur, hielten sich fern von Licht (wir Goat anti-Mouse IgM Cy3-Konjugat, Ziege anti-Maus IgG Cy3-Konjugat, Ziege anti-Ratte IgM Cy3-Konjugat und Ziege anti- Kaninchen Cy3-Konjugat bei 1:300 Verdünnungen).
- Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS.
- Add DAPI (Endkonzentration 1 pg / ml) auf dem letzten Waschen und Inkubation 5 Minuten, um Kerne zu visualisieren.
- Analysieren Sie die Zellen unter Vergrößerung.
Teil 5: Repräsentative Ergebnisse
1. Morphologie Ergebnisse:
Menschliche Fibroblasten Vorhaut (BJ)-Zellen wurden co-transduzierten mit Oct4, Sox2, Nanog und Lin28. Morphologische Veränderungen wurden so früh wie Tag 4 nach der Transduktion beobachtet, und die Ansammlung von Zellen wurde stärker an Tag 17 (Abbildung 1) verpackt. Kolonien wurden manuell am Tag 25 aufgenommen und kultiviert auf CF-1 MEF Feeder-Zellen. Zur Erleichterung der iPS-Zelle Koloniebildung nach der Neuprogrammierung verwendeten wir Stemolecule Y27632, Eine ROCK-Inhibitor, für die erste Nacht Aussaat bei jedem Durchgang. iPS Zellkolonien mit guter Morphologie wurden nach drei aufeinanderfolgenden Runden Kolonie Kommissionierung und Passagieren beobachtet.
2. Expression der Pluripotenz Marker:
Zur weiteren Charakterisierung der isolierten iPS Zellkolonien, schauten wir auf das Vorhandensein von gemeinsamen Pluripotenz Marker in ES-Zellen exprimiert. Die Kolonien zeigten starke alkalische Phosphatase (AP)-Aktivität (Abbildung 2). Darüber hinaus wurde Immunzytochemie (ICC) auf die iPS-Zellen Kolonien mit einem Panel von Pluripotenz-Marker-spezifischen Antikörper durchgeführt, darunter Oberflächenmarker TRA-1 bis 81, TRA-1 bis 60, SECO-4 und SSEA-3 sowie nukleare Marker Oct4, Sox2 und Nanog. Die isolierte iPS Kolonien wurden positiv für alle Marker (Abbildung 3). Die ICC Ergebnisse zeigen, dass die iPS-Zellen die entsprechende Pluripotenz-Marker Expressionsmuster ausgestellt, die zeigen, dass diese iPS-Zellen ähneln undifferenzierten humanen ES-Zellen.
Abbildung 1: Morphologische Veränderungen der transduzierten BJ-Zellen. Hellfeld Bilder von einem typischen iPS-Zelle Kolonie (A) 4 Tage und (B) 17 Tage nach der Transduktion gebildet.
Abbildung 2: AP-Aktivität von umprogrammiert BJ-Zellen. Drei verschiedene Kolonien mit Stemgent alkalische Phosphatase-Färbung Kit gefärbt.
Abbildung 3: Human iPS-Zellen exprimieren ein hohes Maß an folgende ES-Zell-spezifische Marker: Oberflächenmarker TRA-1 bis 81, TRA-1 bis 60, SECO-4 und SSEA-3, und nukleare Marker 4 Oktober, Nanog und Sox2.
Discussion
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Stemgent Menschliche TF Lentivirus Set verwendet werden, um effizient zu generieren iPS Kolonien durch Induktion der ektopische Expression von transduziert werden Transkriptionsfaktoren in humanen Fibroblasten. Bei der Gestaltung Umprogrammierung Experimente sollten mehrere Variablen berücksichtigt, um die Effizienz der Reprogrammierung zu optimieren. Erstens kann der aktive Virus-to-Target-Verhältnis (Multiplizität der Infektion MOI) müssen während der primären Transduktion Schritt, um eine optimale Effizienz zu erreichen Transduktion modifiziert werden. Zweitens kann das Wachstum Zustand der Zielzellen Auswirkungen Neuprogrammierung. Gesunde und vermehrungsfähige Zellen sind leichter zu Neuprogrammierung. Drittens, wenn Änderung des Protokolls für verschiedene Zell-Zahlen, ist es empfehlenswert, Zielzelle Zahlen proportional zur Oberfläche der Kulturschale eingestellt werden. Schließlich sollte die Anwendung ROCK-Inhibitoren wie Y27632 betrachtet, um sicherzustellen, erfolgreiche Reprogrammierung wie jüngste Studien ihren Nutzen bei der Verbesserung der hES Kolonie Überleben nachweisbar sind. 4,5
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human TF Lentivirus Set | Stemgent | 00-0005 | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| TRA-1-81 antibody | Stemgent | 09-0012 | |
| TRA-1-60 antibody | Stemgent | 09-0009 | |
| SSEA-4 antibody | Stemgent | 09-0003 | |
| SSEA-3 antibody | Stemgent | 09-0014 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thompson, J. A. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (1917).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Koyanagi, M., Takahashi, J., Arakawa, Y., Doi, D., Fukuda, H., Hayashi, H., Narumiya, S., Hashimoto, N. Inhibition of the Rho/ROCK pathway reduces apoptosis during transplantation of embryonic stem cell-derived neural precursors. J. Neurosci. Res. 86, 270-280 (2008).
