Summary
Tonen we het protocol voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met behulp van lentivirus-gemedieerde levering van de menselijke factoren Oct4, Sox2, NANOG, en Lin28. Pluripotentie werd bevestigd door morfologie en de aanwezigheid van embryonale stamcellen (ES) cel-specifieke merkers.
Abstract
In 2006, Yamanaka en zijn collega's voor het eerst gedemonstreerd dat retrovirus-gemedieerde levering en expressie van Oct4, Sox2, c-Myc en Klf4 in staat is om de pluripotente staat in muis fibroblasten. 1 Dezelfde groep meldde ook de succesvolle herprogrammering van menselijke somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen met behulp van menselijke versies van dezelfde transcriptiefactoren geleverd door retrovirale vectoren. twee Bovendien, James Thomson et al.. gemeld dat de lentivirus-gemedieerde co-expressie van een andere set van factoren (Oct4, Sox2, NANOG en Lin28 ) was in staat om herprogrammering menselijke somatische cellen in iPS cellen. 3
iPS-cellen zijn vergelijkbaar met ES-cellen in morfologie, proliferatie en het vermogen om te differentiëren in alle soorten weefsels van het lichaam. Menselijke iPS cellen hebben een duidelijk voordeel ten opzichte van ES-cellen als ze vertonen de belangrijkste eigenschappen van embryonale stamcellen, zonder het ethische dilemma van de embryo's vernietigd. Het genereren van patiënt-specifieke iPS cellen omzeilt een belangrijk obstakel om gepersonaliseerde regeneratieve geneeskunde therapieën door het wegnemen van de kans op afstoting van niet-autologe getransplanteerde cellen.
Hier laten we zien het protocol voor herprogrammering menselijke fibroblast cellen met behulp van de Stemgent Human TF lentivirus Set. We tonen ook aan dat cellen die geprogrammeerd met deze set beginnen te iPS tonen morfologie vier dagen na de transductie. Met behulp van de Stemolecule Y27632, kozen we voor iPS cellen en waargenomen juiste morfologie na drie opeenvolgende rondes van kolonie plukken en passage. We tonen ook aan dat na de herprogrammering cellen weergegeven pluripotentie marker AP, oppervlakte markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, en SSEA-3, en nucleaire markers Oct4, Sox2 en NANOG.
Protocol
1. Herprogrammering
- Zaad BJ-cellen bij een dichtheid van 1 x 10 5 cellen per putje van een 6-wells plaat. Cultuur van de cellen in 2 ml groeimedium (450 ml EMEM aangevuld met 50 ml ES gekwalificeerde FBS, 5 ml 10 mM niet-essentiële aminozuren, 5 ml penicilline / streptomycine, 5 ml 200 mM L-glutamine en 0,9 ml 55 mM β -mercapto-ethanol) overnacht bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Op dezelfde dag, beginnen met de voorbereiding MEF feeder platen door de toevoeging van 0,1% gelatine verdund in water tot een 6 wells plaat en incubatie overnacht bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Na incubatie, verwijder medium van de BJ cellen en voeg 2 ml kweekmedium aangevuld met 6 ug / ml van polybreen, 500 ul hOct4-lentivirus, 50 ul hSox2-lentivirus, 50 ul hNanog-lentivirus en 50 ul hLin28-lentivirus aan elk putje . Schud de plaat aan een gelijkmatige laag van het medium te verzekeren. Incubeer overnacht bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Op dezelfde dag, verwijder dan een flacon van CF-een MEF-cellen van vloeibare stikstof en ontdooien. Verwijderen vloeistof uit de gelatine beklede putten (zie stap 1.2) en voeg MEF feeder-cellen bij een dichtheid van 0,2 x 10 5 cellen / well. Het totale volume per goed moet 2 ml van de cellen in MEF groeimedium (450 ml DMEM aangevuld met 50 ml FBS en 5 ml niet-essentiële aminozuren).
- De volgende dag, los BJ cellen met 0,05% trypsine / EDTA en centrifugeer op 200 xg gedurende 5 minuten. Aspireren het medium en resuspendeer in groeimedium. Verwijder medium van de MEF feeder plaat (zie stap 1.4) en voeg 2 ml / putje van de BJ celsuspensie. De concentratie van de cellen moet worden ongeveer 5 x 10 4 cellen / putje. Incubeer overnacht bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Vervang medium 24 uur na het re-enten met menselijke ES / iPS celkweekmedium (400 ml DMEM/F12 aangevuld met 100 ml Knockout Serum Vervanging, 5 ml 10 mM niet-essentiële aminozuren, 5 ml 200 mM L-glutamine, 0,9 ml 55 mM β-mercapto-ethanol en 20 ng / ml humaan recombinant bFGF). Verandering medium elke 24 uur gedurende 7 dagen.
- Na zeven dagen, te wijzigen middellange tot MEF geconditioneerd medium (zie hoofdstuk 2).
2. Voorbereiding van de MEF geconditioneerd medium
- Zaad CF-1 MEF feeder-cellen op 2 x 10 5 cellen / goed op een 6 wells plaat in 2 ml MEF groei medium. Incubeer overnacht bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Verandering medium voor de menselijke ES / iPS celkweekmedium. Incubeer overnacht bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Verzamel supernatant elke 24 uur gedurende vier dagen. Filtreer de bovenstaande vloeistof door een 0,22 urn filter.
- Supplement supernatant met 50 ng / ml bFGF.
3. iPS Colony Selectie en passage
- Selecteer een ES-achtige kolonie en opnieuw zaad in de menselijke ES / IPS kweekmedium aangevuld met 10 uM van Stemolecule Y27632 op celcultuur gerechten pre-bezaaid met CF-1 MEF feeder-cellen. Incubeer overnacht bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Verander het kweekmedium elke 24 uur gedurende de eerste zeven dagen (zonder aan te vullen met Stemolecule Y27632). Na zeven dagen, te wijzigen middellange tot MEF geconditioneerd medium (zie rubriek 2 voor voorbereiding). We bleven passage van de cellen totdat ze toonden typisch menselijke ES morfologie.
4. Immunocytochemische Onderzoek van pluripotentie Markers
- Was de cellen voorzichtig drie keer met PBS.
- Fixeer de cellen met 500 pi van fixatief gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de cellen voorzichtig drie keer met PBS.
- Blokkeer niet-specifieke binding met 500 ul blokkeerbuffer gedurende een uur bij kamertemperatuur.
- Incubeer de cellen met 250 pi van de specifieke primaire antilichaam overnacht bij 4 ° C (gebruikten we TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, SSEA-3, Oct4, Sox2, NANOG en Lin28 op 1:100 verdunningen).
- Was de cellen voorzichtig drie keer met PBS.
- Incubeer de cellen met 250 ul van secundaire antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, waardoor uit de buurt van licht (wij gebruikten geit anti-muis IgM Cy3 conjugaat, geit anti-muis IgG Cy3 conjugaat, geit anti-Rat IgM Cy3 conjugaat en geit anti- konijn Cy3 conjugaat bij 1:300 verdunningen).
- Was de cellen voorzichtig drie keer met PBS.
- Voeg DAPI (eindconcentratie 1 ug / ml) tot de laatste wassen en incubeer 5 minuten kernen te visualiseren.
- Analyseer de cellen onder vergroting.
Deel 5: representatieve resultaten
1. Morfologie Resultaten:
Menselijke voorhuid fibroblast (BJ) cellen werden co-getransduceerde met Oct4, Sox2, NANOG, en Lin28. Morfologische veranderingen werden waargenomen vanaf dag vier post-transductie, en de cluster van cellen werd meer dicht opeengepakte op dag 17 (Figuur 1). Kolonies werden handmatig geplukt op dag 25 en gekweekt op een CF-MEF feeder-cellen. Ter vergemakkelijking van de iPS cellen kolonievorming na de herprogrammering, gebruikten we Stemolecule Y27632, Een ROCK-remmer, voor de eerste overnachting seeding tijdens elke passage. iPS cel kolonies met een goede morfologie werden waargenomen na drie opeenvolgende rondes van kolonie plukken en passage.
2. Expressie van pluripotentie Markers:
Om verder te karakteriseren de geïsoleerde iPS cel kolonies, hebben we gekeken naar de aanwezigheid van gemeenschappelijke pluripotentie markers uitgedrukt in ES-cellen. De kolonies vertoonden sterke alkalische fosfatase (AP) activiteit (figuur 2). Daarnaast werd immunocytochemie (ICC) uitgevoerd op de iPS cel kolonies met een panel van pluripotentie marker-specifieke antilichamen, met inbegrip van oppervlakte markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 en SSEA-3, alsmede nucleaire markers Oct4, Sox2 en NANOG. De geïsoleerde iPS koloniën waren positief voor alle markers (figuur 3). Het ICC resultaten blijkt dat de iPS cellen de juiste pluripotentie marker expressiepatroon tentoongesteld, waaruit blijkt dat deze iPS cellen sterk lijken op ongedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen.
Figuur 1: Morfologische veranderingen van getransduceerde BJ cellen. Helderveld beelden van een typische iPS cel kolonie gevormd bij (A) 4 dagen en (B) 17 dagen na transductie.
Figuur 2: AP activiteit van geherprogrammeerd BJ cellen. Drie verschillende kolonies gekleurd met Stemgent alkalische fosfatase Staining Kit.
Figuur 3: Human iPS cellen brengen hoge niveaus van de volgende ES-cel specifieke markers: oppervlakte markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 en SSEA-3, en nucleaire markers 4 okt NANOG en Sox2.
Discussion
Deze resultaten tonen aan dat de Stemgent Human TF lentivirus Set kan worden gebruikt om efficiënt iPS kolonies genereren door het induceren van de ectopische expressie van transcriptiefactoren getransduceerd in de menselijke fibroblasten. Bij het ontwerpen van herprogrammering experimenten moet met een aantal variabelen worden beschouwd als de efficiëntie van de herprogrammering te optimaliseren. Ten eerste kan de actieve virus-to-target ratio (multipliciteit van infectie MOI) moet worden gewijzigd tijdens de eerste stap naar een optimale transductie transductie efficiëntie te bereiken. Ten tweede kan de groei conditie van de doelcellen invloed herprogrammering. Gezonde en proliferatieve cellen zijn meer vatbaar voor herprogrammering. Ten derde, bij de wijziging van het protocol voor de verschillende cellen nummers, wordt aanbevolen dat de doelcel nummers proportioneel worden aangepast aan de oppervlakte van de cultuur schotel. Ten slotte moet het toepassen van ROCK-remmers, zoals Y27632 worden geacht om te helpen een succesvolle herprogrammering zorgen zoals recente studies hebben aangetoond dat het nut ervan bij het verbeteren van hES overlevingskans van de kolonie. 4,5
Disclosures
De auteurs van dit artikel zijn in dienst van Stemgent dat de reagentia en instrumenten gebruikt in dit artikel oplevert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human TF Lentivirus Set | Stemgent | 00-0005 | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| TRA-1-81 antibody | Stemgent | 09-0012 | |
| TRA-1-60 antibody | Stemgent | 09-0009 | |
| SSEA-4 antibody | Stemgent | 09-0003 | |
| SSEA-3 antibody | Stemgent | 09-0014 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thompson, J. A. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (1917).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Koyanagi, M., Takahashi, J., Arakawa, Y., Doi, D., Fukuda, H., Hayashi, H., Narumiya, S., Hashimoto, N. Inhibition of the Rho/ROCK pathway reduces apoptosis during transplantation of embryonic stem cell-derived neural precursors. J. Neurosci. Res. 86, 270-280 (2008).
