Summary
نبدي بروتوكول لجيل من الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها من الخلايا الجسدية البشرية باستخدام الفيروسة البطيئة بوساطة التسليم من العوامل البشرية Oct4 ، Sox2 ، Nanog وLin28. وأكد تعدد القدرات التي التشكل وجود الجذعية الجنينية (ES) بعلامات محددة الخلية.
Abstract
في عام 2006 ، ياماناكا وزملاؤه أظهرت الأولى التي الارتجاعي بوساطة التسليم والتعبير عن Oct4 ، Sox2 ، C - Myc Klf4 وقادر على حمل الدولة المحفزة في الخلايا الليفية الماوس. (1) المجموعة ذاتها أيضا عن إعادة برمجة الخلايا الجسدية نجاح الإنسان في الجذعية المحفزة التي يسببها (آي بي إس) الخلايا باستخدام الإصدارات الإنسان للعوامل النسخ ذاتها التي ألقاها نواقل فيروسات 2 بالإضافة إلى ذلك ، جيمس طومسون وآخرون. ذكرت أن الفيروسة البطيئة بوساطة شارك في التعبير عن مجموعة أخرى من العوامل (Oct4 ، Sox2 ، وNanog Lin28 ) كان قادرا على إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية الى خلايا الجذع 3
خلايا الجذع تشبه إلى الخلايا ES في الانتشار ، والتشكل ، والقدرة على التمييز في جميع أنواع الأنسجة في الجسم. خلايا الجذع البشرية لديها ميزة واضحة على خلايا ES لأنها مفتاح خواص الخلايا من دون وفاق المعضلة الأخلاقية لتدمير الجنين. توليد خلايا الجذع المريض محددة تلتف حاجز شخصية هامة لعلاجات الطب التجديدي من خلال القضاء على احتمالات الرفض المناعي للخلايا ذاتي غير المزروعة.
نحن هنا لشرح بروتوكول لإعادة برمجة الخلايا الليفية الإنسان باستخدام Stemgent الفيروسة البطيئة TF الإنسان تعيين. علينا أن نبين أن الخلايا برمجتها تبدأ مع هذه المجموعة لاظهار الجذع التشكل بعد أربعة أيام تنبيغ. باستخدام Y27632 Stemolecule ، اخترنا لخلايا الجذع والتشكل الصحيح لوحظ بعد ثلاث جولات متتابعة من مستعمرة انتقاء والركض. علينا أيضا أن تثبت أن إعادة برمجة الخلايا بعد عرض تعدد القدرات AP علامة ، علامات سطح الهيئة - 1 - 81 ، الهيئة - 1 - 60 ، SSEA - 4 ، وSSEA - 3 ، وعلامات Oct4 النووية ، وSox2 Nanog.
Protocol
1. إعادة برمجة
- BJ خلايا البذور في مناطق ذات كثافة من 1 × 5 10 خلايا لكل بئر من لوحة 6 - جيدا. ثقافة الخلايا في 2 مل من وسط النمو (450 مل EMEM تستكمل مع 50 مل FBS ES المؤهلين ، 5 مل 10 ملي غير الأحماض الأمينية الأساسية ، 5 مل البنسلين / الستربتوميسين ، 5 مل 200 ملي L - الجلوتامين و 0.9 مل β ملي 55 - المركابتويثانول) بين عشية وضحاها على 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
- في نفس اليوم ، البدء في إعداد لوحات التغذية MEF بإضافة 0.1 ٪ الجيلاتين المخفف في الماء لوحة 6 جيدا وتفرخ بين عشية وضحاها على 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
- بعد مرور فترة الحضانة ، وإزالة الخلايا متوسطة من BJ والمتوسطة النمو إضافة 2 مل تستكمل مع 6 ميكروغرام / مل من polybrene ، 500 ميكرولتر hOct4 - الفيروسة البطيئة ، 50 ميكرولتر hSox2 - الفيروسة البطيئة ، 50 ميكرولتر hNanog الفيروسة البطيئة ، و 50 ميكرولتر hLin28 الفيروسة البطيئة إلى كل بئر . صخرة بلطف لوحة لضمان وجود طلاء حتى من المتوسط. يحضن بين عشية وضحاها على 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
- في اليوم نفسه ، وإزالة 1 قارورة من الخلايا MEF CF - 1 من النيتروجين السائل وذوبان الجليد. إزالة السائل من الآبار المغلفة الجيلاتين (انظر الخطوة 1.2) وإضافة الخلايا المغذية MEF في مناطق ذات كثافة تبلغ 0.2 X الخلايا 5 10 / أيضا. ينبغي أن الحجم الإجمالي للبئر الواحد يكون 2ml من الخلايا في النمو المتوسطة MEF (450 مل DMEM تستكمل مع FBS 50 مل و 5 مل غير الأحماض الأمينية الأساسية).
- في اليوم التالي ، مع فصل الخلايا BJ 0.05 ٪ التربسين / EDTA وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق. نضح على المديين المتوسط والمتوسطة resuspend في النمو. إزالة لوحة متوسطة من التغذية MEF (انظر الخطوة 1.4) وإضافة 2 مل / إضافة لتعليق الخلية BJ. ينبغي أن يكون تركيز الخلايا حوالي 5 × 10 4 خلايا / جيد. يحضن بين عشية وضحاها على 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
- استبدال المتوسطة بعد 24 ساعة من إعادة البذر مع الإنسان ES / خلية الجذع مستنبت (400 مل DMEM/F12 تستكمل مع 100 مل مصل تبديل خروج المغلوب ، 5 مل 10 ملي غير الأحماض الأمينية الأساسية ، 5 مل 200 ملي L - الجلوتامين و 0.9 مل 55 ملم β - المركابتويثانول و 20 نانوغرام / مل bFGF المؤتلف الإنسان). تغيير المتوسط كل 24 ساعة لمدة 7 أيام.
- بعد سبعة أيام ، وتغير متوسط والمتوسطة MEF مكيفة (انظر القسم 2).
2. إعداد متوسطة MEF مشروطة
- البذور CF - 1 الخلايا المغذية MEF في الخلايا 2 × 5 10 / جيد على لوحة 6 2 مل بشكل جيد في وسط النمو MEF. يحضن بين عشية وضحاها على 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
- تغيير متوسطة إلى الإنسان ES / IPS خلية متوسطة الثقافة. يحضن بين عشية وضحاها على 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
- طاف جمع كل 24 ساعة لمدة أربعة أيام. تصفية طاف عبر مرشح 0.22 ميكرون.
- تكملة طاف مع 50 نانوغرام / مل من bFGF.
3. الجذع اختيار مستعمرة والركض
- حدد مستعمرة ES مثل البذور وإعادة الإنسان في مستنبت ES / IPS تستكمل مع 10 ميكرومتر من Stemolecule Y27632 على أطباق خلية ثقافة ما قبل المصنف مع CF - 1 الخلايا المغذية MEF. يحضن بين عشية وضحاها على 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
- تغيير الثقافة المتوسطة كل 24 ساعة في الأيام السبعة الأولى (بدون المكمل مع Stemolecule Y27632). بعد سبعة أيام ، وتغير متوسط والمتوسطة MEF مكيفة (انظر القسم 2 من أجل الإعداد). واصلنا الركض الخلايا حتى أظهروا نموذجية مورفولوجيا ES الإنسان.
4. Immunocytochemical فحص علامات تعدد القدرات
- غسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
- تحديد الخلايا مع 500 ميكرولتر من مثبت لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
- كتلة غير محددة وملزمة مع العازلة ميكرولتر 500 حظر لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان الخلايا مع 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية محددة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (استخدمنا الهيئة - 1 - 81 ، الهيئة - 1 - 60 ، SSEA - 4 ، SSEA - 3 ، Oct4 ، Sox2 ، وNanog Lin28 في 1:100 التخفيفات).
- غسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
- احتضان الخلايا مع 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، والابتعاد عن الضوء (كنا عنزة المضادة للماوس الغلوبولين المناعي Cy3 المتقارن ، عنزة المضادة للماوس مفتش Cy3 المتقارن ، عنزة مكافحة الجرذ الغلوبولين المناعي Cy3 المتقارن والماعز المضادة الأرنب Cy3 المتقارن في التخفيفات 1:300).
- غسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
- إضافة دابي (تركيز النهائي 1 ميكروغرام / مل) لغسل الماضي ، واحتضان 5 دقائق لتصور النوى.
- تحليل الخلايا تحت التكبير.
الجزء 5 : النتائج الممثل
1. مورفولوجيا النتائج :
وكانت الخلايا الليفية الإنسان القلفة (BJ) خلايا المشترك مع transduced Oct4 ، Sox2 ، Nanog وLin28. وقد لوحظت تغييرات شكلية في وقت مبكر اليوم بعد 4 تنبيغ ، وكتلة من الخلايا أصبحت أكثر معبأة بإحكام في يوم 17 (الشكل 1). واختير يدويا المستعمرات في يوم 25 و مثقف على الخلايا المغذية CF 1 MEF. لتسهيل تشكيل مستعمرة خلية الجذع بعد إعادة برمجة ، استخدمنا Stemolecule Y27632وهو مثبط ROCK ، لبذر ليلة وضحاها الأولي خلال كل مرور. وقد لوحظت خلايا الجذع مع المستعمرات مورفولوجية جيدة بعد ثلاث جولات متتابعة من مستعمرة انتقاء والركض.
2. التعبير عن علامات تعدد القدرات :
لمزيد من تميز الخلية الجذع عزل المستعمرات ، وبحثنا عن وجود علامات تعدد القدرات المشتركة التي أعرب عنها في خلايا ES. عرض المستعمرات قوية القلوية الفوسفاتيز (ا ف ب) النشاط (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك ، تم تنفيذ كيمياء سيتولوجية مناعية (ICC) على مستعمرات الخلايا الجذع مع لجنة من الأجسام المضادة علامة محددة تعدد القدرات ، بما في ذلك علامات سطح الهيئة - 1 - 81 ، الهيئة - 1 - 60 ، SSEA - 4 - 3 SSEA وكذلك علامات النووية Oct4 ، وSox2 Nanog. كانت المستعمرات المعزولة الجذع إيجابية لجميع العلامات (الشكل 3). نتائج المحكمة الجنائية الدولية تظهر أن خلايا الجذع معارضها المناسبة التعبير علامة نمط تعدد القدرات ، مما يدل على أن هذه الخلايا الجذع تشبه خلايا غير متمايزة ES الإنسان.
الشكل 1 : التغيرات المورفولوجية للخلايا transduced BJ. صور مشرقة من حقل مستعمرة نموذجية الخلية التي شكلت في الجذع (A) 4 أيام و (ب) 17 يوما تنبيغ بالوظائف.
الشكل 2 : AP نشاط الخلايا BJ برمجتها. ثلاث مستعمرات مختلفة ملطخة Stemgent القلوية الفوسفاتيز كيت تلطيخ.
الشكل 3 : التعبير عن الإنسان خلايا الجذع على مستويات عالية من علامات ES الخلية المحددة التالية : علامات سطح الهيئة - 1 - 81 ، الهيئة - 1 - 60 ، SSEA - 4 وSSEA - 3 ، وعلامات النووية 4 أكتوبر ، وNanog Sox2.
Discussion
هذه النتائج تثبت أنه يمكن استخدام Stemgent الفيروسة البطيئة TF الإنسان تعيين لتوليد بكفاءة المستعمرات الجذع بالتحريض على التعبير خارج الرحم من transduced عوامل النسخ في الخلايا الليفية الإنسان. عند تصميم التجارب برمجة ، ينبغي النظر في متغيرات عدة لتحسين كفاءة إعادة برمجة. أولا ، قد نشط الفيروس إلى هدف (نسبة تعدد العدوى وزارة الداخلية) يجب أن يتم تعديلها خلال الخطوة تنبيغ الأولية لتحقيق الكفاءة المثلى تنبيغ. الثانية ، يمكن لحالة نمو الخلايا المستهدفة أثر إعادة برمجة. الخلايا السليمة والتكاثري وأكثر تقبلا لإعادة البرمجة. الثالث ، عند تعديل البروتوكول لأعداد مختلفة من الخلايا ، فمن المستحسن أن تعدل أرقام الخلية المستهدفة نسبيا إلى مساحة الصحن الثقافة. أخيرا ، ينبغي النظر مثبطات ROCK تطبيق مثل Y27632 للمساعدة على ضمان نجاح إعادة برمجة كما أثبتت الدراسات الحديثة فائدتها في تعزيز بقاء مستعمرة HES. 4،5
Disclosures
ويعمل واضعو هذه المادة التي تنتج Stemgent الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المقالة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human TF Lentivirus Set | Stemgent | 00-0005 | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| TRA-1-81 antibody | Stemgent | 09-0012 | |
| TRA-1-60 antibody | Stemgent | 09-0009 | |
| SSEA-4 antibody | Stemgent | 09-0003 | |
| SSEA-3 antibody | Stemgent | 09-0014 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thompson, J. A. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (1917).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Koyanagi, M., Takahashi, J., Arakawa, Y., Doi, D., Fukuda, H., Hayashi, H., Narumiya, S., Hashimoto, N. Inhibition of the Rho/ROCK pathway reduces apoptosis during transplantation of embryonic stem cell-derived neural precursors. J. Neurosci. Res. 86, 270-280 (2008).
