Summary
हम मानव दैहिक lentivirus मानव कारकों Oct4, Sox2, Nanog, और Lin28 की डिलीवरी की मध्यस्थता का उपयोग कोशिकाओं से प्रेरित pluripotent स्टेम सेल की पीढ़ी के लिए प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है. Pluripotency आकारिकी और भ्रूण स्टेम सेल (ते) विशिष्ट मार्करों की उपस्थिति द्वारा पुष्टि की गई.
Abstract
2006 में, Yamanaka और उनके सहयोगियों ने पहली बार दिखा दिया है कि retrovirus की मध्यस्थता वितरण और Oct4 की अभिव्यक्ति, Sox2, सी Myc और Klf4 माउस fibroblasts में pluripotent राज्य उत्प्रेरण के लिए सक्षम है 1 एक ही समूह भी मानव दैहिक कोशिकाओं के सफल reprogramming में रिपोर्ट प्रेरित pluripotent स्टेम (आईपीएस) के एक ही प्रतिलेखन रेट्रोवायरल वैक्टर द्वारा दिया कारकों के मानव संस्करणों का उपयोग कोशिकाओं. 2 इसके अलावा, जेम्स थॉमसन एट अल. रिपोर्ट है कि lentivirus की मध्यस्थता सह कारकों का एक और सेट की अभिव्यक्ति (Oct4, Sox2, Nanog और Lin28 ) आईपीएस कोशिकाओं में मानव दैहिक कोशिकाओं reprogramming करने में सक्षम था 3.
आईपीएस कोशिकाओं आकारिकी, प्रसार, और शरीर के सभी प्रकार के ऊतकों में अंतर करने की क्षमता में ES कोशिकाओं के लिए इसी तरह की हैं. मानव आईपीएस कोशिकाओं ES कोशिकाओं पर एक विशिष्ट लाभ है के रूप में वे भ्रूण विनाश के नैतिक दुविधा बिना ES कोशिकाओं के प्रमुख गुण एक्ज़िबिट है. रोगी विशेष के आईपीएस कोशिकाओं की पीढ़ी गैर ऑटोलॉगस प्रतिरोपित कोशिकाओं की प्रतिरक्षा अस्वीकृति के लिए क्षमता को नष्ट करने से व्यक्तिगत पुनर्योजी चिकित्सा उपचार के लिए एक महत्वपूर्ण अंधी गली circumvents.
यहाँ हम Stemgent मानव TF lentivirus सेट का उपयोग मानव fibroblast कोशिकाओं reprogramming के लिए प्रोटोकॉल का प्रदर्शन. हम यह भी पता चलता है कि इस सेट के साथ reprogrammed कोशिकाओं आकारिकी चार पोस्ट पारगमन दिनों आईपीएस को दिखाने के लिए शुरू. Stemolecule Y27632 का प्रयोग, हम कॉलोनी के तीन अनुक्रमिक दौर उठा और passaging के बाद आईपीएस कोशिकाओं और मनाया सही आकारिकी के लिए चुना है. हम यह भी दिखाना है कि बाद reprogramming कोशिकाओं pluripotency मार्कर एपी, टीआरए-1-81 सतह मार्करों, टीआरए-1-60, SSEA 4, और SSEA-3, और परमाणु मार्करों Oct4, Sox2 और Nanog प्रदर्शित.
Protocol
1. Reprogramming
- बीज 1 एक्स 10 5 6 अच्छी तरह से एक थाली के अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं के घनत्व पर बी.जे. कोशिकाओं. संस्कृति मध्यम विकास के 2 मिलीलीटर (450 मिलीलीटर EMEM 50 मिलीलीटर ES योग्य FBS, 5 मिलीलीटर 10 मिमी गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 5 मिलीलीटर पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 5 मिलीलीटर 200 मिमी एल glutamine और 0.9 मिलीलीटर 55 मिमी β के साथ पूरक कोशिकाओं ) mercaptoethanol 37 पर रातोंरात डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
- उसी दिन, 0.1 जिलेटिन% पानी में एक 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए पतला जोड़ने और 37 पर रात में 2 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ incubating MEF फीडर प्लेटों की तैयारी शुरू करते हैं .
- ऊष्मायन के बाद, बी.जे. कोशिकाओं से मध्यम हटाने और एक अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर विकास 6 / polybrene के μg मिलीलीटर के साथ पूरक माध्यम, 500 μl hOct4 lentivirus, 50 μl hSox2 lentivirus, 50 μl hNanog lentivirus और 50 μl hLin28 lentivirus जोड़ने . धीरे थाली रॉक करने के लिए माध्यम की एक भी कोटिंग सुनिश्चित करने के लिए. 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
- उसी दिन, तरल नाइट्रोजन और पिघलना से CF-1 MEF कोशिकाओं की एक शीशी को हटा दें. जिलेटिन लेपित कुओं (1.2 कदम देखें) से तरल निकालें और 0.2 x 10 5 अच्छी तरह / कोशिकाओं के घनत्व पर MEF फीडर कोशिकाओं को जोड़ने . अच्छी तरह से प्रति कक्षों की कुल मात्रा 2ml MEF मध्यम विकास (450 मिलीलीटर DMEM 50 मिलीलीटर FBS और 5 मिलीलीटर गैर आवश्यक अमीनो एसिड के साथ पूरक) में होना चाहिए.
- अगले दिन, 5 मिनट के लिए 200 XG पर 0.05 trypsin / EDTA% और अपकेंद्रित्र के साथ बी.जे. कोशिकाओं को अलग. मध्यम और मध्यम विकास में resuspend Aspirate. MEF फीडर प्लेट (1.4 कदम देखें) से मध्यम निकालें और / बी.जे. सेल निलंबन की अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर जोड़ें. कोशिकाओं की एकाग्रता लगभग 5 x 10 4 कोशिकाओं / अच्छी तरह से किया जाना चाहिए. 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
- मानव कोशिका / ES आईपीएस संस्कृति मध्यम (400 DMEM/F12 मिलीलीटर 100 मिलीलीटर नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट 5 मिलीलीटर, 10 मिमी गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 5 मिलीलीटर 200 मिमी एल glutamine, 0.9 मिलीग्राम के साथ पूरक के साथ मध्यम 24 घंटे के बाद फिर से - बोने बदलें 55 मिमी β mercaptoethanol और 20 एनजी / एमएल पुनः संयोजक मानव bFGF). 7 दिनों के लिए हर 24 घंटे मध्यम बदलें.
- सात दिनों के बाद, MEF वातानुकूलित मध्यम मध्यम (खंड 2 देखें).
2. MEF वातानुकूलित मध्यम की तैयारी
- बीज सीएफ़ 1 2 एक्स 10 5 कोशिकाओं पर MEF फीडर कोशिकाओं / अच्छी तरह से 6 2 मिलीलीटर MEF मध्यम विकास में अच्छी तरह से थाली पर. 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
- मानव कोशिका / ES आईपीएस संस्कृति मध्यम मध्यम बदलें. 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
- चार दिनों के लिए हर 24 घंटे सतह पर तैरनेवाला लीजिए. 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर.
- 50 एनजी / मिलीलीटर bFGF के साथ सतह पर तैरनेवाला अनुपूरक.
3. आईपीएस कालोनी चयन और passaging
- एक ES तरह कॉलोनी और मानव संस्कृति / ES आईपीएस पूर्व CF-1 MEF फीडर कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त सेल संस्कृति बर्तन पर 10 सुक्ष्ममापी Y27632 Stemolecule के साथ पूरक माध्यम में फिर से बीज का चयन करें. 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
- हर 24 घंटे पहले सात दिन (Y27632 Stemolecule के साथ सप्लीमेंट के बिना) के लिए मध्यम संस्कृति बदलें. सात दिनों के बाद, MEF वातानुकूलित मध्यम मध्यम (तैयार करने के लिए धारा 2 देखें). हम कोशिकाओं passaging जारी रखा जब तक वे ठेठ मानव ES morphology दिखाया.
4. Pluripotency मार्करों के Immunocytochemical परीक्षा
- कोशिकाओं धीरे पीबीएस के साथ तीन बार धोएं.
- कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 500 μl लगानेवाला के साथ कोशिकाओं को ठीक करें.
- कोशिकाओं धीरे पीबीएस के साथ तीन बार धोएं.
- कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए 500 μl अवरुद्ध बफर के साथ गैर विशिष्ट बंधनकारी ब्लॉक.
- 4 में विशिष्ट प्राथमिक रातोंरात एंटीबॉडी के 250 μl के साथ कोशिकाओं सेते डिग्री सेल्सियस (हम 1:100 पर टीआरए-1-81, टीआरए-1-60, SSEA 4, SSEA-3, Oct4, Sox2, Nanog और Lin28 उपयोग ) dilutions.
- कोशिकाओं धीरे पीबीएस के साथ तीन बार धोएं.
- माध्यमिक एंटीबॉडी के 250 μl के साथ कोशिकाओं के कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते प्रकाश से दूर रखते हुए (हम बकरी का इस्तेमाल किया विरोधी माउस आईजीएम Cy3 संयुग्म, बकरी विरोधी माउस आईजीजी Cy3 संयुग्म, बकरी विरोधी चूहा आईजीएम Cy3 संयुग्म और बकरी विरोधी 1:300 dilutions पर खरगोश Cy3 संयुग्म).
- कोशिकाओं धीरे पीबीएस के साथ तीन बार धोएं.
- पिछले धोने के लिए DAPI (अंतिम एकाग्रता 1 / μg मिलीलीटर) जोड़ें और 5 मिनट सेते नाभिक कल्पना.
- बढ़ाई तहत कोशिकाओं का विश्लेषण.
भाग 5: प्रतिनिधि परिणाम
1. आकृति विज्ञान परिणाम:
मानव चमड़ी fibroblast कोशिकाओं (बी.जे.) Oct4 के साथ सह - transduced थे, Sox2, Nanog, और Lin28. Morphological परिवर्तन के 4 दिन बाद पारगमन के रूप में जल्दी के रूप में मनाया गया, और कोशिकाओं के क्लस्टर अधिक 17 दिन (चित्रा 1) पर कसकर पैक हो गया. कालोनियों मैन्युअल रूप से 25 दिन में उठाया गया था और सीएफ़-1 MEF फीडर कोशिकाओं पर सभ्य है. Reprogramming के बाद आईपीएस सेल कॉलोनी गठन की सुविधा के लिए, हम Stemolecule Y27632 का इस्तेमाल किया, प्रत्येक यात्रा के दौरान प्रारंभिक रातोंरात बोने के लिए एक रॉक अवरोध करनेवाला,. अच्छा आकारिकी के साथ आईपीएस सेल कालोनियों कॉलोनी के तीन अनुक्रमिक दौर उठा और passaging के बाद मनाया गया.
2. Pluripotency मार्करों की अभिव्यक्ति:
आगे पृथक आईपीएस सेल कालोनियों विशेषताएँ करने के लिए, हम आम pluripotency ES कोशिकाओं में व्यक्त मार्करों की उपस्थिति के लिए देखा. कालोनियों मजबूत alkaline फॉस्फेट (एपी) गतिविधि (चित्रा 2) का प्रदर्शन किया. इसके अतिरिक्त, immunocytochemistry (आईसीसी) आईपीएस कोशिका कालोनियों पर pluripotency मार्कर विशिष्ट एंटीबॉडी के एक पैनल के साथ प्रदर्शन किया गया था सतह टीआरए-1-81 मार्करों, टीआरए-1-60, SSEA-4 और SSEA-3 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परमाणु मार्करों सहित, Oct4, Sox2, और Nanog. पृथक आईपीएस कालोनियों सभी मार्करों (चित्रा 3) के लिए सकारात्मक थे. आईसीसी के परिणाम बताते हैं कि आईपीएस कोशिकाओं उपयुक्त pluripotency मार्कर अभिव्यक्ति पैटर्न का प्रदर्शन किया, प्रदर्शन है कि इन आईपीएस कोशिकाओं के निकट undifferentiated मानव ES कोशिकाओं सदृश.
चित्रा 1: के morphological परिवर्तन बी.जे. कोशिकाओं transduced. एक ठेठ आईपीएस सेल कॉलोनी के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों (ए) 4 दिन और (ख) 17 दिनों के बाद पारगमन का गठन किया.
चित्रा 2: reprogrammed बी.जे. कोशिकाओं के एपी गतिविधि. तीन विभिन्न कालोनियों Stemgent alkaline फॉस्फेट धुंधला किट के साथ दाग.
चित्रा 3: सतह मार्करों टीआरए-1-81, टीआरए-1-60, SSEA-4 SSEA-3, और परमाणु अक्टूबर 4, Nanog और Sox2 मार्करों: मानव आईपीएस कोशिकाओं निम्नलिखित ES सेल विशिष्ट मार्करों के उच्च स्तर को व्यक्त .
Discussion
इन परिणामों दिखाना है कि Stemgent मानव TF lentivirus सेट करने के लिए कुशलतापूर्वक के अस्थानिक अभिव्यक्ति उत्प्रेरण द्वारा आईपीएस कालोनियों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है मानव fibroblasts में प्रतिलेखन कारकों transduced. जब reprogramming प्रयोगों डिजाइन, कई चर reprogramming की दक्षता का अनुकूलन करने के लिए विचार किया जाना चाहिए. सबसे पहले, सक्रिय वायरस के लिए लक्ष्य अनुपात (MOI संक्रमण की बहुलता) प्राथमिक पारगमन के लिए इष्टतम पारगमन दक्षता प्राप्त करने के कदम के दौरान संशोधित किया जा आवश्यकता हो सकती है. दूसरा, लक्ष्य कोशिकाओं के विकास की स्थिति reprogramming को प्रभावित कर सकता है. स्वस्थ और proliferative कोशिकाओं reprogramming करने के लिए उत्तरदायी हैं. तीसरा, जब अलग सेल नंबर के लिए प्रोटोकॉल को संशोधित, यह अनुशंसा की जाती है कि लक्ष्य कक्ष संख्या आनुपातिक संस्कृति डिश की सतह क्षेत्र के लिए समायोजित किया जा. अन्त में, Y27632 रूप में लागू करने रॉक inhibitors के रूप में हाल ही के अध्ययन को बढ़ाने HES कॉलोनी अस्तित्व में इसकी उपयोगिता का प्रदर्शन किया है सफल reprogramming सुनिश्चित करने में मदद के लिए माना जाता है होना चाहिए 4,5.
Disclosures
इस लेख के लेखक Stemgent द्वारा नियोजित है कि अभिकर्मकों और इस लेख में इस्तेमाल उपकरणों का उत्पादन कर रहे हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human TF Lentivirus Set | Stemgent | 00-0005 | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| TRA-1-81 antibody | Stemgent | 09-0012 | |
| TRA-1-60 antibody | Stemgent | 09-0009 | |
| SSEA-4 antibody | Stemgent | 09-0003 | |
| SSEA-3 antibody | Stemgent | 09-0014 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thompson, J. A. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (1917).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Koyanagi, M., Takahashi, J., Arakawa, Y., Doi, D., Fukuda, H., Hayashi, H., Narumiya, S., Hashimoto, N. Inhibition of the Rho/ROCK pathway reduces apoptosis during transplantation of embryonic stem cell-derived neural precursors. J. Neurosci. Res. 86, 270-280 (2008).
