Summary
우리는 인간의 요인 Oct4, Sox2, Nanog, 그리고 Lin28의 lentivirus - 중재 전송을 사용하여 인간의 체세포에서 유도된 pluripotent 줄기 세포의 생성에 대한 프로토콜을 보여줍니다. Pluripotency는 형태학 및 배아 줄기 (ES) 세포 특정 마커의 존재에 의해 확인되었다.
Abstract
2006 년, 야마 나카와 동료 먼저 Oct4의 레트로 바이러스 - 중재 전달과 표현, Sox2, C - Myc와 Klf4는 마우스 섬유아 세포에서 pluripotent 상태를 유도 할 수 있다고 보여주었다. 1 같은 그룹은 또한 인간의 체세포의 성공적인 프로그래밍에보고 retroviral 벡터에 의해 전달 같은 전사 요소의 인간 버전을 사용하여 유도된 pluripotent 줄기 (IPS) 전지 2. 또한, 제임스 톰슨 외가. 보고한 요인의 다른 세트의 lentivirus - 중재 공동 표현 (Oct4, Sox2, Nanog와 Lin28 ) IPS 세포에 인간의 체세포를 프로그래밍 가능했습니다 3.
IPS 세포는 형태, 증식 및 신체의 모든 조직 유형으로 차별화할 수있는 능력의 ES 세포와 비슷합니다. 그들은 배아 파괴의 윤리적 딜레마없이 ES 세포의 주요 특성을 전시 등 인간 IPS 세포는 ES 세포에 비해 뚜렷한 장점이 있습니다. 환자 특정 IPS 세포의 생성이 아닌 autologous 이식 세포의 면역 거부의 가능성을 제거하여 맞춤형 재생 의료의 치료에 중요한 장애물을 circumvents.
여기서 우리는 Stemgent 인간 TF의 Lentivirus 세트를 사용하여 인간 fibroblast 세포를 프로그래밍을위한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 또한이 세트로 다시 프로그램 세포 형태 사일 후 전달 IPS를 표시하기 시작 것을 보여줍니다. Stemolecule Y27632를 사용하여, 우리는 식민지 세 연속 라운드가 따기 passaging 후 IPS 세포와 관찰 올바른 형태를 위해 선택했습니다. 우리는 또한 입증되는 프로그래밍 세포 pluripotency 마커 AP, 표면 마커 트라 - 1 - 81, 트라 - 1 - 60, SSEA - 4, SSEA - 3와, 그리고 핵 마커 Oct4, Nanog Sox2 및 표시 후.
Protocol
1. 프로그래밍
- 6 잘 플레이트 잘 당 1 × 10 5 세포의 밀도에 시드 BJ 세포. 문화 성장 매체 2 ML (450 ML EMEM 50 ML ES 자격 FBS, 5 ML 10 MM이 아닌 필수 아미노산, 5 ML 페니실린 / 스트렙토 마이신, 5 ML 200 MM의 L - 글루타민과 0.9 ML 55 MM의 β와 보충의 세포 37 하루 - 메르 캅 토 에탄올) ° C와 5% CO 2.
- 같은 날, 6 잘 접시에 물에 희석 젤라틴 0.1 %를 추가하고 37 ° C 야간 및 5% CO 2 잠복기하여 MEF 피더 플레이트를 준비하고 시작합니다.
- 부화 후, BJ 세포에서 매체를 제거하고 각 잘하는 polybrene 6 μg / ML과 보완이 ML 성장 매체, 500 μl hOct4 - lentivirus, 50 μl hSox2 - lentivirus, 50 μl hNanog - lentivirus 50 μl hLin28 - lentivirus을 추가 . 부드럽게 매체도 코팅을 보장하기 위해 접시를 바위. 37 밤새 품어 ° C와 5% CO 2.
- 같은 날, 액체 질소와 해동에서 CF - 1 MEF 세포 1 병을 제거합니다. 젤라틴 코팅 우물 (단계 1.2 참조)에서 액체를 제거하고 0.2 × 10 5 세포 / 음의 밀도에 MEF 피더 세포를 추가합니다. 물론 당 전체 볼륨은 MEF 성장 매체 (450 ML DMEM 50 ML FBS 및 5 ML 아닌 필수 아미노산과 보충)에서 세포의 2ml해야합니다.
- 다음날 5 분 200 XG에서 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 원심 분리기와 BJ 세포를 분리합니다. 성장 매체 매체와 resuspend을 대기음. MEF 피더 플레이트 (단계 1.4 참조)에서 미디어를 제거하고 / 잘 BJ 세포 현탁액 2 ML를 추가합니다. 세포의 농도는 약 5 X 10 4 셀 / 잘해야합니다. 37 밤새 품어 ° C와 5% CO 2.
- 인간의 ES / IPS 세포 배양 매체 (400 ML DMEM/F12 100 ML의 넉아웃 세럼 교체, 5 ML 10 MM이 아닌 필수 아미노산, 5 ML 200 MM L - 글루타민, 0.9 ML로 보충과 함께 중간 24시간 다시 시딩 이후를 교체 55 음 β - 메르 캅 토 에탄올 20 ML / NG 인간 재조합 bFGF). 7 일 동안 24 시간마다 중간 변경합니다.
- 7 일 후에, (섹션 2 참조) MEF 시설 중간 중간 변경합니다.
2. MEF 에어컨 매체의 준비
- 시드 CF - 1 2 × 10 5 세포에서 MEF 피더 세포 / 음 2 ML MEF 성장 매체에서 6 잘 접시에. 37 밤새 품어 ° C와 5% CO 2.
- 인간의 ES / IPS 세포 배양 매체 매체를 변경합니다. 37 밤새 품어 ° C와 5% CO 2.
- 나흘 동안 24 시간마다 뜨는 수집합니다. 0.22 μm의 필터를 통해 뜨는을 필터링합니다.
- bFGF 50 NG / ML로 뜨는 보충.
3. IPS 콜로니 선택과 Passaging
- 세포 배양 접시 CF - 1 MEF의 피더 세포와 함께 미리 씨앗에 Stemolecule Y27632 10 μm의 보충과 함께 인간의 ES / IPS 문화 매체 ES 같은 식민지 다시 씨앗을 선택합니다. 37 밤새 품어 ° C와 5% CO 2.
- 처음 7 일 (Stemolecule Y27632과 보완하지 않고)을 24 시간마다 중간 문화를 변경합니다. 7 일 후에 (준비 섹션 2 참조) MEF 시설 중간 중간 변경합니다. 그들은 일반적인 인간 ES의 형태를 보여주 때까지 우리는 세포를 passaging 계속했다.
4. Pluripotency 마커 Immunocytochemical 시험
- 세포에게 PBS로 가볍게 세 번 씻으십시오.
- 실온에서 20 분 정착액 500 μl와 세포를 수정.
- 세포에게 PBS로 가볍게 세 번 씻으십시오.
- 상온에 한 시간 동안 500 μl 차단 버퍼가 아닌 특정 바인딩을 차단합니다.
- 4 하룻밤의 특정 기본 항체 250 μl와 세포를 품어 ° C (우리는 1:100에서 트라 - 1 - 81, 트라 - 1 - 60, SSEA - 4, SSEA - 3, Oct4, Sox2, Nanog와 Lin28을 사용 dilutions).
- 세포에게 PBS로 가볍게 세 번 씻으십시오.
- (우리가 안티 마우스 IgM Cy3 공액, 염소 안티 - 마우스 IgG Cy3 공액, 염소 방지 랫 IgM Cy3 공액 및 염소 안티 - 염소를 사용하여 빛으로부터 멀리 보관, 실온에서 1 시간 동안 이차 항체 250 μl와 세포를 품어 1:300 dilutions에서 래빗 Cy3 공액).
- 세포에게 PBS로 가볍게 세 번 씻으십시오.
- 마지막으로 씻어 DAPI를 (최종 농도가 1 μg / ML) 추가하고 핵을 시각화하기 위해 5 분 알을 품다.
- 확대에 따라 세포를 분석할 수 있습니다.
제 5 부 : 대표 결과
1. 형태 결과 :
인간 포피의 fibroblast (BJ) 세포는, Sox2, Nanog, Lin28과 Oct4와 함께 공동 transduced되었습니다. 형태학의 변경 사항은 4 일 후 전달 빠르면 관찰하고, 세포의 클러스터보다 밀접하게 일 17 일 (그림 1)에서 포장되었다되었습니다. 식민지는 수동 일 25 들어서 CF - 1 MEF의 피더 세포에 교양되었습니다. 프로그래밍 후 IPS 세포 콜로니 형성을 촉진하기 위해, 우리는 Stemolecule Y27632을 사용각 통과하는 동안 초기 밤새 시딩의 바위 억제제. 좋은 형태로 IPS 세포 식민지는 식민지 세 연속 라운드가 따기 passaging 후 관찰했다.
2. Pluripotency 마커 표현 :
더욱 고립 IPS 세포 식민지를 특성화하기 위해, 우리는 ES 세포에서 표현 일반 pluripotency 마커의 존재를 보았다. 식민지는 강한 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (AP) 활동 (그림 2)을 전시. 또한, immunocytochemistry (ICC)는 표면 마커 트라 - 1 - 81, 트라 - 1 - 60, SSEA - 4 및 SSEA - 3뿐 아니라 핵 마커를 포함하여, pluripotency 마커 특정 항체의 패널과 IPS 세포 식민지에서 수행되었다 Oct4, Nanog Sox2 및. 절연 IPS의 식민지 모든 마커 (그림 3)에 대한 긍정했다. ICC의 결과는 IPS 세포가 이러한 IPS 세포가 밀접하게 undifferentiated 인간의 ES 세포를 닮은 것을 보여주는, 적절한 pluripotency 표시자 표현식 패턴을 전시 것을 보여줍니다.
그림 1 :의 형태학의 변화 BJ 세포를 transduced. 일반적인 IPS 세포 콜로니의 명시야 이미지 (A) 4 일 (B) 17 일 후 전달에서 형성.
그림 2 : 다시 프로그램 BJ 세포의 AP 활동. 세 가지 식민지는 Stemgent 알칼리성 인산 가수 분해 효소의 스테 이닝 키트 물들다.
그림 3 : 표면 마커 트라 - 1 - 81, 트라 - 1 - 60, SSEA - 4 및 SSEA - 3, 핵 마커 10월 4일, Nanog와 Sox2 : 인간 IPS 세포는 다음과 ES 세포 특정 마커의 높은 수준을 표현.
Discussion
이러한 결과는 인간의 섬유아 세포에서 전사 요소를 transduced Stemgent 인간 TF의 Lentivirus 세트가 효율적으로의 이소성 표현을 유도하여 IPS의 식민지를 생성하는 데 사용할 수있는 것을 보여줍니다. 프로그래밍 실험을 설계할 때, 몇 가지 변수는 프로그래밍의 효율성을 최적화하는 것으로 간주되어야합니다. 첫째, 활성 바이러스에 대 목표 비율 (감염 뫄의 다중성)은 최적의 전달 효율을 달성하기 위해 기본 전달 단계에서 수정해야 할 수 있습니다. 둘째, 대상 세포의 성장 상태는 프로그래밍 영향을 줄 수 있습니다. 건강하고 proliferative 세포 프로그래밍을 더 의무가 있습니다. 셋째, 서로 다른 세포 숫자에 대한 프로토콜을 수정할 때, 그것은 대상 셀 번호가 문화 요리의 표면 영역에 비례 조정하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 같은 Y27632으로 적용 록 저해제는 최근 연구에서 향상 hES 콜로니 생존에의 유틸리티를 보여준 것처럼 성공적인 프로그래밍을 보장하기 위해 고려되어야합니다. 4,5
Disclosures
이 문서의 저자는이 문서에서 사용되는 시약 및 악기를 생산 Stemgent 고용하고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human TF Lentivirus Set | Stemgent | 00-0005 | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| TRA-1-81 antibody | Stemgent | 09-0012 | |
| TRA-1-60 antibody | Stemgent | 09-0009 | |
| SSEA-4 antibody | Stemgent | 09-0003 | |
| SSEA-3 antibody | Stemgent | 09-0014 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thompson, J. A. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (1917).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
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