Summary
Vi visar protokollet för generering av inducerade pluripotenta stamceller från mänskliga somatiska celler med lentivirus-medierade leverans av mänskliga faktorer Oct4, Sox2, NANOG och Lin28. Pluripotens bekräftades av morfologi och förekomst av embryonala stamceller (ES) cell-specifika markörer.
Abstract
Under 2006 Yamanaka och kollegor först visade att retrovirus-medierad leverans och uttryck Oct4, Sox2, c-Myc och Klf4 kan förmå pluripotenta staten i musfibroblaster. 1 Samma grupp rapporterade också den framgångsrika omprogrammering av mänskliga somatiska celler in inducerade pluripotenta stamceller (IPS) celler använder mänskliga versioner av samma transkriptionsfaktorer som levereras av retrovirala vektorer. 2 Dessutom James Thomson et al. rapporterade att lentivirus-medierad co-uttryck för en annan uppsättning faktorer Oct4 (, Sox2, NANOG och Lin28 ) kunde omprogrammering mänskliga somatiska celler till iPS-celler. 3
iPS-celler liknar ES-celler i morfologi, spridning och möjligheten att differentiera till alla typer av vävnad i kroppen. Mänskliga iPS-celler har en klar fördel framför ES-celler som de uppvisar viktiga egenskaper hos ES-celler utan det etiska dilemmat av embryon förstörs. Den generation av patient-specifika iPS-celler kringgår en viktig vägspärr till personliga regenerativ medicin terapier genom att eliminera risken för avstötning av icke-autologa transplanterade celler.
Här kan vi visa protokollet för omprogrammering mänskliga fibroblast celler med Stemgent mänskliga TF lentivirus Set. Vi visar också att celler omprogrammeras med denna uppsättning börja visa iPS morfologi fyra dagar efter transduktion. Använda Stemolecule Y27632 valde vi för iPS-celler och observerade korrekta morfologi efter tre sekventiella rundor av koloni plockning och passaging. Vi visar också att efter omprogrammering celler visas de pluripotens markör AP, yta markörer TRA-1-81 TRA-1-60, SSEA-4 och SSEA-3, och nukleära markörer Oct4, Sox2 och NANOG.
Protocol
1. Omprogrammering
- Seed BJ celler vid en densitet på 1 x 10 5 celler per brunn i en 6-brunnar. Kultur cellerna i 2 ml odlingsmedium (450 ml EMEM kompletteras med 50 ml ES kvalificerad FBS, 5 ml 10 mM icke-essentiella aminosyror, 5 ml penicillin / streptomycin, 5 ml 200 mM L-glutamin och 0,9 ml 55 mM β -merkaptoetanol) över natten vid 37 ° C och 5% CO 2.
- Samma dag, börja förbereda MEF matare plattor genom att tillsätta 0,1% gelatin utspätt i vatten till en 6 brunnar och inkuberas över natten vid 37 ° C och 5% CO 2.
- Efter inkubering, ta bort mediet från BJ cellerna och tillsätt 2 medelstora ml tillväxt kompletteras med 6 mikrogram / ml polybrene, 500 l hOct4-lentivirus, 50 l hSox2-lentivirus, 50 l hNanog-lentivirus och 50 l hLin28-lentivirus i varje brunn . Skaka plattan att säkerställa en jämn beläggning av mediet. Inkubera över natten vid 37 ° C och 5% CO 2.
- Samma dag, ta bort en flaska med CF-1 MEF celler från flytande kväve och tina. Ta bort vätskan från gelatin brunnarna (se steg 1.2) och lägga till celler MEF matare vid en densitet av 0,2 x 10 5 celler / brunn. Den totala volymen per brunn bör vara 2 ml av celler i MEF tillväxtmedium (450 ml DMEM kompletteras med 50 ml FBS och 5 ml icke-essentiella aminosyror).
- Nästa dag, ta bort BJ celler med 0,05% trypsin / EDTA och centrifugera vid 200 xg under 5 minuter. Aspirera mediet och återsuspendera i tillväxt medium. Ta bort mediet från MEF mataren plattan (se steg 1.4) och tillsätt 2 ml / brunn av BJ cellsuspension. Koncentrationen av celler bör vara ungefär 5 x 10 4 celler / brunn. Inkubera över natten vid 37 ° C och 5% CO 2.
- Byt medelhög 24 timmar efter re-seeding med mänskliga ES / IPS cellkulturmedium (400 ml DMEM/F12 kompletteras med 100 ml Knockout Serum Replacement, 5 ml 10 mM icke-essentiella aminosyror, 5 ml 200 mM L-glutamin, 0,9 ml 55 mm β-merkaptoetanol och 20 ng / ml humant rekombinant bFGF). Ändra medelstora varje 24 timmar under 7 dagar.
- Efter sju dagar, byta medium till MEF betingad medium (se avsnitt 2).
2. Beredning av MEF Konditionerat Medium
- Seed CF-1 MEF feeder celler på 2 x 10 5 celler / brunn på en 6 brunnar i 2 ml MEF tillväxt medium. Inkubera över natten vid 37 ° C och 5% CO 2.
- Byt medellång till mänskliga ES / IPS cellkulturmedium. Inkubera över natten vid 37 ° C och 5% CO 2.
- Samla supernatanten var 24 timmar i fyra dagar. Filtrera supernatanten genom ett 0,22 ìm filter.
- Tillägg supernatanten med 50 ng / ml bFGF.
3. iPS Colony Urval och Passaging
- Välj ett ES-liknande koloni och nytt utsäde i mänskliga ES / IPS odlingsmedium kompletteras med 10 mikrometer i Stemolecule Y27632 på rätter cellkultur före ympats med CF-1 celler MEF matare. Inkubera över natten vid 37 ° C och 5% CO 2.
- Byt odlingsmedium var 24 timmar för de första sju dagarna (utan att komplettera med Stemolecule Y27632). Efter sju dagar, byta medium till MEF betingad medium (se avsnitt 2 för beredning). Vi fortsatte passaging cellerna tills de visade typiska mänskliga ES morfologi.
4. Immuncytokemiska Undersökning av pluripotens Markörer
- Tvätta cellerna försiktigt tre gånger med PBS.
- Fixera cellerna med 500 ìl fixativ i 20 minuter i rumstemperatur.
- Tvätta cellerna försiktigt tre gånger med PBS.
- Blockera icke-specifik bindning med 500 l blockerande buffert i en timme vid rumstemperatur.
- Inkubera cellerna med 250 l av de specifika primära antikroppen över natten vid 4 ° C (vi använde TRA-1-81 TRA-1-60, SSEA-4, SSEA-3, Oct4, Sox2, NANOG och Lin28 på 1:100 spädningar).
- Tvätta cellerna försiktigt tre gånger med PBS.
- Inkubera cellerna med 250 l av sekundära antikroppar i 1 timme i rumstemperatur, hålla borta från ljus (vi använde get anti-mus-IgM Cy3 konjugat, get anti-mus IgG Cy3 konjugat, get anti-Rat IgM Cy3 konjugat och get anti- Kanin Cy3 konjugatet till 1:300 utspädning).
- Tvätta cellerna försiktigt tre gånger med PBS.
- Lägg DAPI (slutlig koncentration 1 mikrogram / ml) till den sista tvättningen och inkubera 5 minuter att visualisera kärnor.
- Analysera cellerna under förstoring.
Del 5: representativa resultat
1. Morfologi Resultat:
Mänskliga förhuden fibroblast (BJ) celler var tillsammans transduced med Oct4, Sox2, NANOG och Lin28. Morfologiska förändringar observerades så tidigt som dag 4 post-transduktion, och kluster av celler blev mer tätt packade vid dag 17 (Figur 1). Kolonierna var manuellt plockade vid dag 25 och odlade på CF-1 MEF matare celler. För att underlätta iPS bildandet cellen koloni efter omprogrammering använde vi Stemolecule Y27632, En sten-hämmare, för den första natten sådd under varje passage. iPS-celler kolonier med goda morfologi observerades efter tre sekventiella rundor av koloni plockning och passaging.
2. Redovisning av pluripotens markörer:
För att ytterligare karakterisera isolerade iPS-celler kolonier, vi tittade på förekomst av gemensamma pluripotens markörer uttryckt i ES-celler. Kolonierna visade starka alkaliska fosfataser (AP) (Figur 2). Dessutom var immuncytokemi (ICC) utförs på iPS-celler kolonier med en panel av pluripotens markör-specifika antikroppar, inklusive yta markörer TRA-1-81 TRA-1-60, SSEA-4 och SSEA-3 samt kärnkraft markörer Oct4, Sox2 och NANOG. De isolerade iPS kolonierna var positiva för alla markörer (Figur 3). ICC Resultaten visar att iPS-celler uppvisade lämpliga pluripotens mönstret markör uttryck, visar att dessa iPS-celler liknar odifferentierade mänskliga ES-celler.
Figur 1: morfologiska förändringar av transduced BJ celler. Ljusa fält bilder av en typisk iPS cell kolonin bildades vid (A) 4 dagar och (b) 17 dagar efter transduktion.
Figur 2: AP aktivitet omprogrammeras BJ celler. Tre olika kolonier färgas med Stemgent Alkaliskt fosfatas Staining Kit.
Figur 3: mänskliga iPS-celler uttrycker höga nivåer av följande specifika ES-celler markörer: ytan markörer TRA-1-81 TRA-1-60, SSEA-4 och SSEA-3 och kärnkraft markörer 4 oktober, NANOG och Sox2.
Discussion
Dessa resultat visar att Stemgent mänskliga TF lentivirus set kan användas för att effektivt skapa iPS kolonierna genom att inducera den ektopisk uttryck för transduced transkriptionsfaktorer i mänskliga fibroblaster. Vid utformningen av omprogrammering experiment bör flera variabler anses optimera effektiviteten i programplaneringen. Det första kan aktivt virus-to-target förhållande (mångfald av infektion MOI) måste ändras under den primära transduktion steg för att uppnå optimal transduktion effektivitet. För det andra kan tillväxten skick målceller påverkan omprogrammering. Friska och proliferativa celler är mer mottagliga för omprogrammering. Det tredje, när du ändrar protokollet för olika cell nummer, rekommenderas att målcellen siffror justeras i proportion till ytan av kulturen skålen. Slutligen bör tillämpa ROCK-hämmare som Y27632 anses bidra till en framgångsrik omprogrammering eftersom nya studier har visat sin nytta i att öka hES koloni överlevnad. 4,5
Disclosures
Författarna av denna artikel är anställda av Stemgent som producerar reagens och instrument som används i denna artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human TF Lentivirus Set | Stemgent | 00-0005 | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| TRA-1-81 antibody | Stemgent | 09-0012 | |
| TRA-1-60 antibody | Stemgent | 09-0009 | |
| SSEA-4 antibody | Stemgent | 09-0003 | |
| SSEA-3 antibody | Stemgent | 09-0014 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thompson, J. A. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (1917).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Koyanagi, M., Takahashi, J., Arakawa, Y., Doi, D., Fukuda, H., Hayashi, H., Narumiya, S., Hashimoto, N. Inhibition of the Rho/ROCK pathway reduces apoptosis during transplantation of embryonic stem cell-derived neural precursors. J. Neurosci. Res. 86, 270-280 (2008).
