Summary
ジェームズトムソンらが文化の中でヒトESを分離し、成長し、1998年の技術を開発して以来、後で使用するためと凍結ストックからの細胞を解凍し、拡大して凍結細胞は、ルーチンヒトES細胞培養で行われる重要な手続きとなっている。ヒトES細胞は凍結融解のストレスに対して非常に敏感であるため、特別な注意が必要です。ここでは、急速に、液体窒素の在庫からヒトES細胞を融解マウス胚性フィーダー細胞上にめっき、ゆっくりと長期保存のためにそれらを凍結するための適切な手法を示す。
Abstract
ジェームズトムソン以来
Protocol
1。解凍hES細胞
プレ実験のセットアップ
- 一日前に解凍hES細胞に、プレートMEF培地でゼラチンコート6ウエル組織培養プレート（D - MEM基礎培地を添加した1つのウェル上に照射したマウス胚性線維芽細胞（MEF）、CF1系統、のフィーダー層10％熱不活性化FBS、1％非必須アミノ酸）。 37℃および5％CO 2を一晩インキュベートする。
- 液体窒素からヒトES細胞を除去する前に、場所と効率的かつ成功した融解を確保するために使用する準備に必要なすべての機器と試薬を用意してください。
hES細胞を融解
- 金属製のピンセットを用いて液体窒素貯蔵タンクからのヒトES細胞の極低温バイアルを取り外します。
- 霜を取り除くために3〜5秒のために手袋をはめた手の間にバイアルを転がし。
- バイアルのラベルに情報を記録します。
- 金属製のピンセットを使用して、37℃の水浴中にバイアルを浸す。スワール優しくバイアルおよび氷結晶のサイズを確認するには、光にバイアルを保持することによって（ただしすぐに！）多くの場合、解凍の進行状況を観察。沈める水浴中でバイアルのキャップを、これは細胞を汚染する可能性として使用しないでください。
- 唯一の小さな氷の結晶が残っている、水没殺菌にエタノールで全体バイアル。
- 無菌生物学的安全キャビネット内で、15 mLコニカルチューブの底に直接低温バイアルの内容を転送します。
- 徐々にヒトES細胞培養培地を4mL（20％ノックアウト血清代替物、1％非必須アミノ酸、1％L -グルタミン、0.2％β-メルカプトエタノール、4 ngの/を補充D-MEM/F-12基礎培地を追加するチューブへの添加のbFGF）。ゆっくりと新しいメディアがチューブに追加されるよう継続的に細胞を混合して揺らし。
- 200 × gで5分間、細胞を遠心分離
hES細胞をめっき
- 細胞株、継代数、および融解日付：ヒトES細胞は遠心分離している一方で、適切なhES細胞の情報で標識することにより、MEFフィーダープレートを準備。
- スピン時に残された約2分がある場合には、MEFの培地を吸引し、ウェルにPBS 1.0 mLを加える。
- 生物学的安全キャビネットに戻ってペレット化hES細胞を持参し、慎重に上清を吸引除去する。細胞ペレットを吸引しますが、このソリューションは凍結培地からDMSOが含まれているように、上清をできるだけ削除しないように注意してください。
- ペレットは、5 mLのガラスピペットを用いてヒトES細胞培養の培地2.5 mLを加えると3-4回ピペッティングして、非常に穏やかに再懸濁する。
- よくMEFフィーダーからPBSを吸引除去し、徐々に6ウェルプレートのウェル準備するためにヒトES細胞懸濁液のすべての2.5 mlを加える。
- 37℃のインキュベーターにプレートを置き、慎重に均等によく中の細胞を配布する側にバックアップするために前方にプレート、そして側面をスライドさせます。中央のコロニーを集中避けるために、円を描くように旋回プレートをしないでください。
- 細胞は37℃、一晩5％CO 2を添付することができます。
- 雪解け後の日、培地を除去（あらゆる浮遊細胞を使用）と同様に新鮮なhES細胞の培養液の2.5 mlを加える。
- オプション：削除された培地と細胞が別々の準備MEFフィーダープレートに転送することができます。このステップでは、多くの場合、元の融解から細胞と並行して培養することができる新たなコロニーを生成します。
- 37℃、5％CO 2で一晩培養する。
2。 hES細胞の凍結
- ヒトES細胞は遠心分離されている間、細胞株、継代数、および凍結日付を含む生物学的安全キャビネット内部の極低温バイアルを、ラベルを付けます。凍結ヒトES細胞の典型的な密度は、極低温バイアル当たりの細胞の1つのウェル（6ウェルプレートから）です。
- ヒトES細胞を遠心分離が終了したら、生物学的安全キャビネットにチューブを戻す。ゆるく充填された細胞ペレットを乱さないように注意しながら、チューブから上清を吸引除去する。
- 極低温バイアルあたり0.5mLのヒトES細胞培養用培地：ヒトES細胞培養培地の適切な量で細胞ペレットを再懸濁します。 hES細胞は、比較的大きなコロニーの部分で凍結時より回復として、ピペッティング時に非常に穏やかである。
- ゆっくり、静かにチューブを振とうしながら、細胞に2XヒトES細胞凍結培地の適切な量（クライオバイアルあたり0.5mL）を（FBS、20％ヒトES細胞培養培地、および20％DMSO定義されている60％）を加える。一度凍結培地をピペットで混合するために1〜2回は非常に優しく、ソリューションに追加されます。
- 迅速かつ慎重に、各極低温バイアルに細胞懸濁液1 mLを加える。
- のイソプロパノール冷凍コンテナと所定の位置にバイアルを移す-80℃冷凍庫で一晩。細胞は、1 ° Cイソプロパノール冷凍コンテナで毎分フリーズします。
- 翌日、すぐに金属製のピンセットを用いて液体窒素貯蔵タンクに凍結バイアルを移す。
代表的な結果
ヒトES細胞を融解している最初の日の後、小さなコロニーが透明に表示されることがありますし、顕微鏡下で確認することが困難な場合があります。新たに融解したES細胞はゆっくり増殖する傾向があるので、彼らは確立されたコロニー（図1）として表示されるまで数日かかることがあります。
図1。液体窒素から解凍した細胞の回復と成長。hES細胞は、撮像した 1、解凍後7および11日間。
Discussion
付属のビデオは、hES細胞を解凍して凍結する方法を示しています。液体窒素で凍結した細胞は、最適な回復を得ることが可能な限り迅速にお風呂を解凍してください。融解細胞をピペッティング時に非常に慎重に覚えている：細胞のハンドリングを最小限に抑え、穏やかにピペッティング。 hES細胞の1バイアルを6ウェルプレート、または4ウェルプレートの全ウェルのもどちらか一方に播種し、直ちにインキュベーター内に配置することができます。 4つの別々のウェル中の培養は汚染全体の文化を失う可能性を減らし、そしてより簡単に、面積比でhES細胞のコロニーを見つけるために作られることになるので、初めてのためにヒトES細胞を解凍するとき、4ウェルプレートをお勧めします。
hES細胞を融解後の最初の日、コロニーは小さく、透明であってもよい。それが確立されたコロニーとして出現するヒトES細胞の培養に数日かかる場合がありますので、コロニーは、顕微鏡下で明らかにされていない場合でも、毎日hES細胞の培養液を補充。コロニーは、多くの場合12日間解凍後10日まで継代のための適切なサイズに達していないとして、それは、細胞を解凍するときに新鮮なメッキMEFフィーダー層を使用することが重要です。
hES細胞の低継代バイアルを解凍するとき、それは将来の文化や実験のための低継代細胞のストックを維持するために追加のバイアルを拡大し、凍結することをお勧めします。また、日常的に凍結ストックを維持するためにすべての"余分な"健康なヒトES細胞を凍結することをお勧めします。最も成功して融解し、その後の培養は、積極的にhES細胞のコロニーを分割し、未分化、高品質として凍結した。大きな細胞凝集体として緩やかに処理した場合はhES細胞は、より効率的に凍結から回復。最終的な集合体のサイズは、ルーチンの経過後に播種凝集体のサイズ（またはより少し大きい）のようになります。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF mediumjavascript:void(0); |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
| D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | Type A, Porcine |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2560 | For freezing medium |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | Hyclone | SH300.70.01 | For freezing medium |
| 6-well plates | Nalge Nunc international | 140675 | For general culture |
| 4-well plates | Nalge Nunc international | 176740 | For thawing |
| 5 mL glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-27E | Individually wrapped |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene |
| Cryogenic vials | Nalge Nunc international | 5000-1020 | 1.5 mL capacity |
| Freezing container | Nalge Nunc international | 5100-0001 | Mr. Frosty” |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
