Summary
Desde James Thomson et al desarrollaron una técnica en 1998 para aislar y hacer crecer hES en cultivo, las células de congelación para su uso posterior y el deshielo y la ampliación de las células de un stock congelado se han convertido en importantes procedimientos realizados en el cultivo de rutina hES celular. Dado que las células hES son muy sensibles a las tensiones de la congelación y descongelación, debe tomar especial cuidado. Aquí se demuestra la técnica adecuada para descongelar rápidamente las células hES de las reservas de nitrógeno líquido, revestimiento de las células de ratón en el alimentador de embriones, y poco a poco de congelación para almacenamiento a largo plazo.
Abstract
Desde James Thomson
Protocol
1. Descongelación hES células
Pre-montaje experimental
- Un día antes de descongelar las células hES, la placa de una capa alimentadora de fibroblastos de ratón irradiados embrionarias (MEF), cepa CF1, en un pocillo de una gelatina con cubierta de 6 y la placa de cultivo de tejidos en el medio de cultivo MEF (D-MEM medio basal suplementado con 10% de SFB inactivado por calor y el 1% no aminoácidos esenciales). Incubar toda la noche a 37 ° C y CO 2 al 5%.
- Antes de extraer las células hES de nitrógeno líquido, asegúrese de tener todo el equipo necesario y los reactivos en su lugar y listo para usar para asegurar un deshielo eficiente y exitosa.
Descongelar las células hES
- Eliminar un vial criogénico de las células hES desde el tanque de nitrógeno líquido de almacenamiento con unas pinzas de metal.
- Girar el vial entre las manos enguantadas de 3.5 segundos para eliminar la escarcha.
- Registrar la información en la etiqueta del vial.
- Con unas pinzas de metal, sumergir el frasco en un baño de agua a 37 ° C. Agitar suavemente el vial y observar el progreso de la descongelación a menudo (pero rápido!) Manteniendo el frasco a la luz para ver el tamaño de los cristales de hielo. No sumerja la tapa del frasco en el baño de agua, ya que podría contaminar las células.
- Cuando sólo un cristal de hielo pequeños restos, sumergir el frasco entero en etanol para esterilizar.
- En una cabina de seguridad biológica estéril, transferir el contenido del vial criogénico directamente a la parte inferior de un tubo cónico de 15 ml.
- Poco a poco agregue 4 ml de medio de cultivo celular hES (D-MEM/F-12 medio basal suplementado con el reemplazo de 20% de suero golpe de gracia, un 1% no aminoácidos esenciales, 1% de L-glutamina, un 0,2% β-mercaptoetanol y 4 ng / mL bFGF) en el tubo. Agite suavemente para mezclar continuamente las células como el nuevo medio se añade al tubo.
- Centrifugar las células durante 5 minutos a 200 x g.
Revestimiento de las células hES
- Mientras que las células son hES en la centrífuga, preparar la placa de alimentación MEF, mediante el etiquetado con la información de la célula apropiada hES: la línea celular, el número de pases, y la fecha de deshielo.
- Cuando hay aproximadamente 2 minutos por jugarse en el tiempo de giro, se aspira el medio de cultivo MEF y agregar 1,0 ml de PBS para el bienestar.
- Llevar el granulado células hES de nuevo a la cabina de seguridad biológica, y con mucho cuidado aspirar el sobrenadante. Tenga cuidado de no aspirar el pellet de células, pero eliminar la mayor cantidad sobrenadante como sea posible, ya que esta solución contiene DMSO del medio de congelación.
- Vuelva a suspender el pellet con mucho cuidado por la adición de 2,5 ml de medio de cultivo celular hES usando una pipeta de vidrio de 5 ml y pipeta 3-4 veces.
- Aspirar el PBS del alimentador MEF bien y poco a poco agregar todos los de 2,5 ml de la suspensión celular hES al bien preparado de la placa de 6 pocillos.
- Colocar la placa en la incubadora a 37 ° C y deslice la placa de adelante hacia atrás, de lado a lado para distribuir uniformemente las células a través del pozo. No girar la placa en un patrón circular para evitar la concentración de las colonias en el centro.
- Permiten a las células para conectar a 37 ° C CO 2 y el 5% durante la noche.
- El día después de la descongelación, se elimina el medio (con la presencia de células flotantes) y añadir 2,5 ml de medio de cultivo fresco hES celular a la fuente.
- Opcional: El medio removido y las células pueden ser transferidos a un plato preparado por separado alimentador MEF. Este paso suele generar nuevas colonias que pueden ser cultivados en paralelo con las células del deshielo original.
- Las placas se incuban a 37 ° C CO 2 y el 5% durante la noche.
2. Congelación de las células hES
- Mientras que las células son hES en la centrífuga, la etiqueta de los viales criogénicos el interior de la cabina de seguridad biológica, incluyendo la línea celular, el número de pases, y la fecha de congelación. La densidad típica para la congelación de las células hES es un bien de las células (de una placa de 6 pocillos) por vial criogénico.
- Cuando las células hES terminado de centrifugación, llevar los tubos de nuevo a la cabina de seguridad biológica. Aspirar el sobrenadante del tubo, teniendo cuidado de no perturbar la suelta llena de sedimento celular.
- Resuspender el botón celular con la cantidad apropiada de medio hES cultivo celular: 0,5 ml de células hES medio de cultivo por vial criogénico. Sea muy cuidadoso al pipetear, como las células hES se recuperan mejor cuando se congela en la colonia piezas relativamente grandes.
- Poco a poco, mientras agitando suavemente el tubo, añada la cantidad apropiada (0,5 ml por criovial) de 2X medio de congelación hES celular (60% de SFB se define, el 20% medio celular hES la cultura, y el 20% DMSO) a las células. Una vez que el medio de congelación, se añade, la solución de pipeta muy suavemente una o dos veces para mezclar.
- Rápidamente, pero suavemente, agregar 1 ml de la suspensión celular a cada vial criogénico.
- La transferencia de los viales en un contenedor de congelación isopropanol y el lugar enun congelador de -80 ° C durante la noche. Las células se congelan a 1 ° C por minuto en el recipiente de congelación de isopropanol.
- Al día siguiente, de forma rápida transferencia de los viales congelados a un tanque de nitrógeno líquido de almacenamiento con unas pinzas de metal.
Resultados representante
El primer día después de que las células embrionarias humanas se descongelan, pueden aparecer pequeñas colonias transparentes y puede ser difícil de ver bajo el microscopio. Desde recién descongelado células madre embrionarias tienden a proliferar lentamente, pueden tardar varios días en aparecer en las colonias establecidas (Figura 1).
Figura 1. La recuperación y el crecimiento celular. HES células descongeladas del nitrógeno líquido son imágenes 1, 7 y 11 días después de la descongelación.
Discussion
El video que acompaña muestra un método para la descongelación y la congelación de las células hES. Las células congeladas en nitrógeno líquido debe ser descongelado baño tan pronto como sea posible para obtener la mejor recuperación posible. Recuerde que debe tener mucho cuidado al pipetear células deshielo: minimizar la manipulación de las células y la pipeta suavemente. Un vial de células hES puede ser chapada en cualquiera de los dos pocillos de una placa de 6 pocillos, o todos los pocillos de una placa de 4 bien y colocarse inmediatamente en la incubadora. Desde el cultivo en cuatro pozos separados reduce la posibilidad de perder toda la cultura a la contaminación, y hace más fácil para localizar colonias hES celda en la superficie más pequeña, la placa de 4 y se recomienda descongelar las células hES por primera vez.
El primer día después de la descongelación las células hES, las colonias son pequeñas y pueden ser transparentes. Reponer las células hES medio de cultivo todos los días, aunque las colonias no son visibles bajo el microscopio, ya que puede tardar algunos días en la cultura de las células hES para aparecer como las colonias establecidas. Es importante utilizar una capa MEF alimentador recién plateado descongelar las células, como las colonias a menudo no llegan a un tamaño apropiado para los pases hasta el 10 de 12 días después de la descongelación.
Cuando se descongela un vial paso bajo de células HES, es una buena práctica para ampliar y la congelación de los viales adicionales para mantener un stock de células de paso bajo para futuros cultivos y experimentos. También es una buena idea de congelar sistemáticamente todos los "extra" las células sanas hES de mantenimiento de existencias congeladas. El deshielo de más éxito y de las culturas posteriores han sido bloqueados por alta calidad, diferenciado, de forma activa división de las colonias de células hES. células hES recuperarse de una congelación de manera más eficiente si se maneja con cuidado, como los agregados de células grandes. El tamaño total final debe ser similar a (o ligeramente más grande que) el tamaño de los agregados plateado después de un viaje de rutina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF mediumjavascript:void(0); |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
| D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | Type A, Porcine |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2560 | For freezing medium |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | Hyclone | SH300.70.01 | For freezing medium |
| 6-well plates | Nalge Nunc international | 140675 | For general culture |
| 4-well plates | Nalge Nunc international | 176740 | For thawing |
| 5 mL glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-27E | Individually wrapped |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene |
| Cryogenic vials | Nalge Nunc international | 5000-1020 | 1.5 mL capacity |
| Freezing container | Nalge Nunc international | 5100-0001 | Mr. Frosty” |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
