Summary
Eftersom James Thomson et al utvecklat en teknik 1998 för att isolera och odla hES i kultur har frysa celler för senare användning och upptining och expanderande celler från en frusen lager blivit viktiga ingrepp i rutinmässiga hES cellkultur. Eftersom hES celler är mycket känsliga för påfrestningar av frysning och upptining skall särskild omsorg tas. Här kan vi visa den rätta tekniken för att snabbt tina hES celler från flytande kväve lager, plätering dem på musen embryonala feeder celler, och långsamt frysa dem för långtidsförvaring.
Abstract
Eftersom James Thomson
Protocol
1. Upptining hES-celler
Pre-experimentella Set-up
- En dag före upptining hES celler, platta en feeder lager av bestrålade möss embryonala fibroblaster (MEF), CF1 stam, på en brunn i en gelatin-belagd 6-och vävnadsodling plattan i MEF odlingssubstrat (D-MEM bassubstratets kompletteras med 10% värmeinaktiveras FBS och 1% icke-essentiella aminosyror). Inkubera över natten vid 37 ° C och 5% CO 2.
- Innan du tar bort hES celler från flytande kväve, se till att ha all nödvändig utrustning och reagenser på plats och redo att använda för att säkerställa ett effektivt och framgångsrikt tina.
Upptining hES-celler
- Ta bort en kryogen flaska hES celler från flytande kväve ackumulatortanken med hjälp av metall peang.
- Rulla injektionsflaskan mellan handskar på händerna i 3-5 sekunder för att ta bort frosten.
- Spela in informationen på flaskans etikett.
- Av metall pincett, sänk flaskan i ett 37 ° C vattenbad. Snurra injektionsflaskan försiktigt och observera utvecklingen av tina ofta (men snabbt!) Genom att hålla flaskan mot ljuset för att se storleken på isen kristall. Doppa inte locket på flaskan i vattenbadet, eftersom detta kan förorena celler.
- När endast en liten iskristall kvar, dränka hela flaskan i etanol för att sterilisera.
- I en steril biologiska säkerhetsskåp, överföring av innehållet i kryogen flaskan direkt till botten av en 15 ml koniska rör.
- Långsamt Tillsätt 4 ml av hES cellkulturmedium (D-MEM/F-12 bassubstratets kompletteras med 20% Knockout serum ersättare, 1% icke-essentiella aminosyror, 1% L-glutamin, 0,2% β-merkaptoetanol och 4 ng / mL bFGF) till röret. Skaka att ständigt blanda celler som det nya mediet läggs till röret.
- Centrifugera cellerna i 5 minuter vid 200 x g.
Plätering hES-celler
- Medan hES celler i centrifugen, förbereda MEF matare plattan genom märkning med lämplig hES cellinformation: cellinje, passage nummer och tina datum.
- När det är ca 2 minuter kvar på snurra tid, aspirera MEF odlingsmedium och tillsätt 1,0 mL PBS till brunnen.
- Ta med pelleterat hES-celler tillbaka till biologisk säkerhet skåp, och försiktigt aspirera supernatanten. Var noga med att inte aspirera cellpelleten, men ta bort så mycket supernatanten som möjligt, eftersom denna lösning innehåller DMSO från frysning mediet.
- Återsuspendera pelleten mycket försiktigt genom att tillsätta 2,5 mL hES cellkulturmedium med en 5 pipett ml glasflaska och pipettering 3-4 gånger.
- Sug PBS från MEF matare väl och långsamt lägga till alla 2,5 ml av hES cellsuspension till väl förberedd för 6-brunnar.
- Placera plattan i 37 ° C inkubator och skjut försiktigt plattan framåt till bakåt och från sida till sida att fördela de celler i hela väl. Inte snurra plattan i ett cirkulärt mönster för att undvika att koncentrera kolonierna i centrum.
- Låt cellerna att fästa vid 37 ° C och 5% CO 2 över en natt.
- Dagen efter tö, ta bort medium (med någon flytande celler) och tillsätt 2,5 ml av färsk hES cellkulturmedium till brunnen.
- Tillval: Den borttagna medium och celler kan överföras till en separat förberedd MEF matare plattan. Detta steg skapar ofta nya kolonier som kan odlas parallellt med celler från den ursprungliga tina.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C och 5% CO 2 över en natt.
2. Frysa hES-celler
- Medan hES celler i centrifugen, etikett det kylmedium flaskorna inne i biologisk säkerhet skåp, inklusive cellinje, passage nummer och frysning datum. Den typiska densitet för frysning hES-celler är en väl av celler (från en 6-brunnar) per kryogen flaska.
- När hES-celler är klar centrifugering, ta rören tillbaka till biologisk säkerhet skåp. Aspirera supernatanten från röret försiktigt så att inte störa den löst packade cellpelleten.
- Resuspendera cellpelleten med lämplig mängd hES cellkulturmedium: 0,5 ml hES cellkulturmedium per kryogen flaska. Var mycket försiktig vid pipettering, som hES cellerna återhämta sig bättre när frysta i relativt stor koloni bitar.
- Långsamt, medan försiktigt skaka röret, tillsätt lämplig mängd (0,5 ml per cryovial) av 2X hES cell frysning medelstora (60% definierat FBS, 20% hES cellodling medium, och 20% DMSO) till cellerna. När frysning mediet läggs till, lösningen Pipettera extremt försiktigt en till två gånger för att blanda.
- Snabbt men försiktigt, tillsätt 1 ml av cellsuspensionen till varje kryogen flaskan.
- Överför injektionsflaskor till en isopropanol frysning behållare och placera ien -80 ° C frys över natten. Cellerna fryser vid 1 ° C per minut i isopropanol frysning behållaren.
- Följande dag, snabbt överföra den frysta flaskorna till en flytande kväve ackumulatortank med hjälp av metall peang.
Representativa resultat
Den första dagen efter mänskliga ES-celler tinas kan små kolonier synas tydligt, och kan vara svåra att se i mikroskop. Eftersom nyligen tinade ES-celler har en tendens att föröka sig långsamt, kan de ta några dagar att visas som etablerade kolonier (Figur 1).
Figur 1. Cell återhämtning och tillväxt. HES celler tinade från flytande kväve var avbildas 1, 7 och 11 dagar efter upptining.
Discussion
Den medföljande videon demonstrerar en metod för upptining och frysning hES celler. Celler fryses i flytande kväve ska tinas badet så snabbt som möjligt för att få bästa möjliga återhämtning. Kom ihåg att vara mycket försiktig vid pipettering upptining celler: minimera hanteringen av cellerna och pipetten försiktigt. En flaska med hES-celler kan beläggas på antingen en brunn på en 6-brunnar, eller alla brunnar i ett 4-brunnar och omedelbart placeras i inkubatorn. Eftersom odling i fyra separata brunnar minskar risken för att förlora hela kulturen till förorening, och gör det lättare att hitta hES cell kolonier på den mindre ytan är 4-brunnar rekommenderas vid upptining hES celler för första gången.
Den första dagen efter upptining hES celler, kolonier är små och kan vara transparent. Fylla på hES cellkulturens medium varje dag, även om kolonierna inte är uppenbara i mikroskop eftersom det kan ta några dagar i kultur för hES celler att framstå som etablerade kolonier. Det är viktigt att använda en nyligen pläterat lager MEF matare när upptining celler, som kolonier ofta inte nå en lämplig storlek för passaging tills 10 12 dagar efter den tina.
När upptining en låg passage flaska hES celler är det god sed att expandera och frysa extra flaskor för att upprätthålla ett lager av låg passage celler för framtida kultur och experiment. Det är också en bra idé att rutinmässigt frysa alla "extra" friska hES-celler för att upprätthålla frysta lager. De mest framgångsrika tinar och efterföljande kulturer spärrades på hög kvalitet, odifferentierade, aktivt dela hES cell kolonier. hES celler återhämta sig från en frysning mer effektivt om de hanteras varsamt som större cellaggregat. Den slutliga sammanlagda storlek bör vara ungefär lika (eller något större än) storleken på aggregaten klädd efter en rutin passage.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF mediumjavascript:void(0); |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
| D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | Type A, Porcine |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2560 | For freezing medium |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | Hyclone | SH300.70.01 | For freezing medium |
| 6-well plates | Nalge Nunc international | 140675 | For general culture |
| 4-well plates | Nalge Nunc international | 176740 | For thawing |
| 5 mL glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-27E | Individually wrapped |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene |
| Cryogenic vials | Nalge Nunc international | 5000-1020 | 1.5 mL capacity |
| Freezing container | Nalge Nunc international | 5100-0001 | Mr. Frosty” |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
