Summary
Den zebrafisk maxillary skäggtöm är en integumentary sinnesorgan som innehåller ektodermal, mesodermal och neurala derivat krön. Viktigare, kan den vuxna skäggtöm regenerera efter proximal amputation. Denna video presenterar överkäken skäggtöm utveckling och visar ett kirurgiskt protokoll för att få förnyelse, följt av insamling, inbäddning och nedströms avbildning av skäggtöm exemplar.
Abstract
Skäggtömmar är hud sensoriska bihang som finns i fiskar, reptiler och amfibier. Den zebrafisk, Danio rerio, utvecklar två par skäggtömmar-kort nasal par och en längre maxillary par. Barbel vävnad innehåller celler av ektodermal, mesodermal och neurala crest ursprung, inklusive hudceller, körtlar, smaklökar, melanocyterna, fartyg cirkulationsrubbningar och sensoriska nerver. Skillnad från de flesta vuxna vävnader, är maxillary skäggtöm optiskt klar, tillåter oss att visualisera utveckling och underhåll av dessa typer av vävnad under hela livscykeln.
Denna video visar tidiga utvecklingen av att käk skäggtöm (början cirka en månad efter befruktningen) och visar ett kirurgiskt protokoll för att få förnyelse i den vuxna bihang (> 3 månader efter befruktning). Kortfattat är den vänstra överkäken skäggtöm av en sövda fisk förhöjda med steril pincett precis distalt om den bakre kanten av överkäke. En fin, sterila våren sax är placerad mot pincett för att klippa skäggtöm axeln på denna nivå, upprättande av en anatomisk landmärke för amputation planet. Regenerativ tillväxt kan mätas med avseende på detta plan, och i jämförelse med det kontralaterala skäggtöm. Barbel vävnader regenererar snabbt och når maximal återväxt inom 2 veckor efter skadan.
Tekniker för att analysera regenererade skäggtöm inkluderar dissekera och inbäddning matchade par skäggtömmar (regenererar och kontroll) i brunnarna i en vanlig DNA-elektrofores gel. Inbäddade exemplar är bekvämt fotograferade under ett stereomikroskop för grov morfologi och morfometri, och kan lagras i veckor innan nedströms applikationer såsom paraffin histologi, cryosectioning och / eller hela montera immunohistokemi. Dessa metoder fastställa maxillary skäggtöm som en ny in vivo vävnader för att studera förnyelseförmåga flera celltyper i genetiska sammanhang zebrafisk.
Protocol
Zebrafisk djurhållning
Zebrafisk hålls och föds upp enligt standard metoder 1. Tidigare den sena larver period kan utvecklingsstadiet av en zebrafisk mätas genom dess standardlängd (SL), eller den raka linjen avståndet i millimeter från anteriormost punkten av överläppen till basen på stjärtfenan (posteriormost hypural platta) 2. Vid ungefär en månad efter befruktningen (10-12 mm SL), näsans och maxillary skäggtömmar visas som transparenta epitelial knoppar nära lukt gropar och på den bakre hörn maxillae, respektive. Som zebrafisk mognar, de skäggtömmar sträcker sig in smal, morrhår-liknande bihang. Eftersom maxillary skäggtöm är större (2-3 mm) och lättare att manipulera, gäller våra protokoll endast denna särskilda bihang, liknande metoder, men kunde anpassas till de mindre nasal skäggtöm.
Barbel Clipping
- Bedöva vuxen zebrafisk på önskad skede (t ex., 1,5-2,5 cm SL, ~ 3-6 månader efter befruktning) genom nedsänkning i 0,015% MS-222 (etyl 3-aminobensoat methanesulfonate) buffrad till pH 7,0 i systemet vatten. Observera tills simma rörelser stannar och Gill ventilation blir långsam och regelbunden. Beroende på fiskens storlek, tar komplett anestesi ca 2-5 minuter.
- Använda ett akvarium fishnet, överföring 1-3 fiskar åt gången för att en vikt bit blött hushållspapper i en petriskål. Med hjälp av en trubbig spatel, orientera fisken så de är parallella med varandra och vänstra laterala sida upp. Vik del av vått papper handduk över caudal delen av fisken, som täcker hela kroppen upp till gällocket (Gill täcker) för att hålla huden och gälarna fuktiga under förfarandet.
- Visa Petri plattan under stereomikroskop, med låg vinkel infallande ljus att lysa upp huvudet regionen. Fokusera på basen av vänstra överkäken skäggtöm, som sticker ut från den bakre ventrala hörnet av överkäken (Figur 1).
Figur 1. - Hårt tag i skaftet på skäggtöm något distalt kanten av överkäke. Höj skäggtöm axeln och sätter i käftarna på en spetsig fjäder sax strax proximalt om pincett. Saxen kan beröras med pincett för stabilitet. Skjut käftar sax längs axeln av skäggtöm tills spetsen närmar sig kanten av överkäke. Stäng sax för att skära igenom skäggtöm axeln. Den amputerade skäggtöm, fortfarande fast i tången, kan tas bort för fixering eller ytterligare observation.
- Överför omedelbart fisken till en liten tank med rent system vatten (~ 500 ml) innehåller en droppe metylenblått att kontrollera ytliga svampinfektion. Låt fisken att återhämta sig under natten. Nästa morgon återvänder fisken till uppfödning systemet. Barbel regenerering är maximal efter 2 veckor.
Agar Inbäddning av matchade Barbel par
- Samla fisk av lämpliga dödshjälp teknik och fixa i en 50 ml tub med 4% paraformaldehyd-fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med agitation vid 4 ° C över natten. Den fixativ volymen bör vara minst tio gånger volymen av vävnaden. Efter fixering, kassera paraformaldehyd avfall i en godkänd behållare och skölj vävnaden noggrant i flera förändringar av PBS.
- Förbered i en 250 ml glasflaska 150 ml 2% agaros (T m ~ 37 ° C) i destillerat vatten. Värme med en mikrovågsugn eller värmeplatta, agiterat regelbundet tills allt löst sig. Jämvikta den smälta lösning i en 50-60 ° C vattenbad.
- Montera en vanlig rigg gelelektrofores genom att placera en liten packningsförsedda gel mögel (10 x 10 cm, ~ 100 ml gel volym) ordentligt mot sidorna av bufferten kammaren. Lägg till 2-4 små-tandade urval kammar (4 x 1,5 mm).
- På en plan yta, häll den smälta agarosen i formen för att bara täcka basen av kammar, bildar mycket grunda brunnar. Omedelbart satte överblivna agarosen tillbaka i varmt vattenbad, vilket kommer att användas senare för att bädda in vävnad (steg 9-12). Sätt en lång glas pasteurpipett i kolven för att hålla pipetten till samma temperatur som agarosen.
- Låt gelen stelna i 20-30 minuter. Ta bort kammar, ta sedan bort gelen mögel som innehåller härdade gelen från bufferten kammaren. Fast tejpen de öppna sidorna av gelen mögel med laborationer tejp så att gelen inte glida ut. Detta band bör omfatta flera millimeter över ytan av agarosen så att ytterligare agaros kan läggas till senare (steg 13).
- Placera gelen mögel på scenen i ett stereomikroskop. Förstora en tom bra och få kanterna i fokus.
- På ytan av agarosen intill brunnen, pipett en droppe vatten eller buffert som innehåller den fasta skäggtöm prover (t.ex., förnya och kontroll). USIng böjda insekt stift drar fuktiga prover i brunnen och pressa dem till botten. Orientera skäggtöm axlarna parallellt med varandra och anpassas mot motstående långa kanter väl. Ytspänning kommer att hjälpa hålla vävnaden på plats.
- När du är redo att bädda in, använd en fin pipettspets eller hörnet av ett laboratorium vävnad för att ta bort överflödig vätska från brunnen. Arbeta snabbt för att inte låta vävnaden torka ut.
- Använda värmde glaset pasteurpipett försiktigt pipettera färska smälta agarosen i och runt prover för att försegla skäggtöm vävnaden på plats. Fyll inte. Innan agarosen hårdnar, gör sista minuten justeringar med insekt stift.
- Placera en numrerad etikett papper exemplar bredvid brunnen och fäst den med en liten droppe agaros.
- Upprepa steg 6 till 10 för varje brunn av prover.
- Om så önskas för bild kalibrering, sätt en bit papper med en tryckt mikrometerskala (t.ex. http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/ ) i botten av en tom bra. Platta papperet till botten av brunnen och täck den med varmt agaros.
- När alla prover är inbäddade, kommer ytan på gelen vara oregelbunden, med härdat droppar agaros. Placera gelen på en plan yta och försiktigt hälla i ytterligare smält agaros tills ovansidan är enhetlig. Använd den minsta mängden agaros krävs för att få en slät yta, för mycket agaros skymmer överförs ljus fotografering. Låt den här översta lagret härda.
- Gelen kan nu fotograferas på scenen av ett stereomikroskop att registrera grov morfologi för varje skäggtöm par. Bild kalibrering erhålls genom att fotografera den inbyggda mikrometerskala.
- Hela Gelen kan lagras inlindad i blött hushållspapper och förseglade i en plastpåse vid 4 ° i flera veckor.
- För vidare analys kan agar block som innehåller matchande par av skäggtömmar skäras ut ur gelen med en skalpell eller rakblad och behandlas för paraffin histologi eller cryosectioning av standardmetoder 3,4. Alternativt kan enskilda skäggtömmar skäras ut ur agaros med fina nålar, sköljas i vatten och behandlas för andra tillämpningar i efterföljande led (t.ex. hel-fäste immunohistokemi eller konfokalmikroskopi).
Discussion
Den zebrafisk maxillary skäggtöm är en underutnyttjad vävnad för att studera tillväxt, underhåll och förnyelse av flera celltyper i zebrafisk. Även om skäggtöm bihang har inga mänskliga analoga, är de celltyper den innehåller starkt konservativa, vilket gör det möjligt att studera hud, körtlar, melanocyterna, cirkulationsrubbningar fartyg och nerver i ett optiskt klara och anatomiskt enkel cylindrisk struktur. I likhet med väl studerade stjärtfenan, kan skäggtöm vävnad förmås att återskapa genom amputation. Använda gränsen till överkäken som anatomiska landmärke kan amputation planet placeras exakt, vilket underlättar mätning av skäggtöm återväxt. För en erfaren operatör tar varje operation bara några sekunder. Återvinning är snabb, och vi har hittills upptäckt några korta eller långsiktiga effekter på fisk beteende. Zebrafisk med en maxillary skäggtöm bada, äta och ras så effektivt som icke-kirurgiska kontroller, och har jämförbara överlevnad till tiden av vävnad samling, upp till 6 månader efter operationen. Den fysiologiska effekten av denna operation förväntas vara minimal, eftersom 1) den extraorala smaklökar transporteras på skäggtöm finns också på många andra delar av fisken epitel, inklusive läppar, kinder och huvud 5, och 2) att skilja smaklökar visas på den regenererande skäggtöm inom 72 timmar (LeClair et al. opublicerade data.) Detta gör maxillary skäggtöm en minimalinvasiv system för att studera sårläkning, revaskularisering och reinnervation inom ramen för en vuxen ryggradsdjur.
Efter kirurgisk induktion av förnyelse kan skäggtömmar samlas med jämna mellanrum för morfometriska mätningar och / eller mikroskopisk analys av fast vävnad. Bekvämt är maxillary skäggtöm ungefär längden (2-3 mm) och diameter (100-200 mm) av en zebrafisk embryo, underlätta tillämpningen av många standardprotokoll, inklusive paraffin histologi, cryosectioning, hel-fäste immunohistokemi och in situ hybridisering. Sammantaget gör dessa funktioner att käk skäggtöm en mycket möjlig in vivo modell för att studera vävnad reparation och förnyelse.
Acknowledgments
Dessa metoder har utvecklats av EEL under ett forskningsprojekt lämnar i labbet av JT Stöd lämnades av DePaul University Vetenskapsrådet och en NIH / NIDCR R01 bidrag till JT (DE016678). Vi erkänner tacksamt insatser Caroline Hunter, djurvård tekniker i CMRC zebrafisk core facility och Paulina Pawluczuk, vår grundutbildning laboratorieassistent.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A stereo dissecting microscope with transmitted and incident fiber-optic illumination is required for barbel clipping and agar embedding | |||
| Fish system water | |||
| 2 zebrafish crossing tanks | |||
| MS-222 (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate; Sigma Chemical #E10521-10G) | |||
| sterile 120-mm Petri plate | |||
| wet paper towels | |||
| blunt metal spatula | |||
| Dumont #55 Bio Inox Forceps (Fine Science Tools #11255-20) | |||
| Mini-Vannas spring scissors (Fine Science Tools #15000-00) | |||
| methylene blue antifungal agent (Drs. Foster & Smith #CD-905781) | |||
| small aquarium fishnet | |||
| 4% paraformaldehyde in 1x phosphate-buffered saline (PF-PBS), aliquoted into 50 mL conical tubes and stored frozen at -20°C until use | |||
| 1x phosphate-buffered saline (pH 7.27-6) | |||
| 250 mL glass flask | |||
| 2% agarose in distilled water | |||
| standard small agarose gel electrophoresis rig (gel size = ~10 cm square) | |||
| small-toothed electrophoresis sample comb (comb size 4 x 1.5 mm) | |||
| warm water bath (50-60°C) | |||
| laboratory tape | |||
| black enameled insect pins, size 000 (Fine Science Tools #26000-25) | |||
| 1-2 pin holders (Fine Science tools #26016-12) | |||
| 9-inch glass Pasteur pipette | |||
| pipette bulb or pump | |||
| laboratory tissue | |||
| small paper labels | |||
| (optional) printed calibration scale | |||
| wet paper towels | |||
| zip-closure plastic bag | |||
| scalpel/razor blade (to cut out agar blocks) |
References
- Westerfield, M. Chapter 1 General Methods for Zebrafish Care. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Howe, J. C. Standard length: Not quite so standard. Fisheries Research (Amsterdam). 56, 1-7 (2002).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 6, (2008).
- Westerfield, M. Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Hansen, A., Reutter, K., Zeiske, E. Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio. Dev Dyn. 223, 483-496 (2002).
