Een techniek om tegelijkertijd Visualiseer virus-specifieke CD8 + T-cellen en virus-geïnfecteerde cellen In situ Published: August 13, 2009 doi: 10.3791/1561

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Qingsheng Li¹, Pamela J. Skinner², Lijie Duan¹, Ashley T. Haase¹

¹Department of Microbiology, Medical School, University of Minnesota, ²Department of Veterinary and Biomedical Sciences, University of Minnesota

Summary

Een techniek combineert in situ tetrameer vlekken en in situ hybridisatie (ISTH) maakt visualisatie, in kaart brengen en analyseren van de ruimtelijke nabijheid van virus-specifieke CD8 + T-cellen om hun virus-geïnfecteerde targets, en de bepaling van de kwantitatieve relaties tussen deze immuun-effectoren en doelstellingen voor infecties resultaten.

Abstract

De aantallen en locaties van virus-specifieke CD8 + T-cellen ten opzichte van de aantallen en locaties van de geïnfecteerde cel targets is gedacht om kritisch te zijn bij het bepalen van de resultaten die variëren van afstand tot chronische hardnekkige infecties. We beschrijven hier een methode voor het beoordelen van de ruimtelijke en kwantitatieve relaties tussen immuun effector (E)-virus-specifieke CD8 + T-cellen en geïnfecteerde targets (T) dat de combinatie van in situ tetrameer (IST) kleuring te detecteren virus-specifieke CD8 + T-cellen en in situ hybridisatie (ISH) om virale-RNA + cellen op te sporen in de weefsels, waar de strijd tussen afweer en infectie plaatsvindt. De combinatie van IST-kleuring en ISH, afgekort ISTH, maakt visualisatie en in kaart brengen van de locaties van immune effector cellen en doelstellingen, en de gemakkelijke bepaling van de E: T ratio. Deze parameters op hun beurt kunnen dan gebruikt worden om de relatie tussen ruimtelijke nabijheid te bepalen, en de timing en omvang van de immuunrespons die resultaten te voorspellen in het beginstadium van de infectie.

Protocol

Deze methode werd gebruikt in het onderzoek gerapporteerd in Li et al.., Science 323, 1726-1729 (2009) .

Gecombineerd in situ tetrameer vlekken en in situ hybridisatie (ISTH) procedures

ISTH procedures kan worden onderverdeeld in vier stappen: 1) IST kleuring van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen in de weefsels, 2) ISH om virus-geïnfecteerde-RNA + cellen te detecteren; 3) confocale microscopische beeldvorming van de IST-gekleurde cellen en viraal-RNA + cellen; 4) beeldanalyse, inclusief de bouw van het beeld montages en in kaart brengen van de tetrameer + en virus-RNA + cellen.

1. IST kleuring van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen in weefselcoupes.

1. Gesneden verse weefsels in 200 um dikke secties met behulp van een vibratome of scalpel.
2. Chill vibratome bad met steriele PBS-H en chill tot 0-2 ° C. Zet de vibratome bladhoek een vrij steile 27 °. Waar mogelijk, houden weefsel gekoeld op ijs, om degradatie te minimaliseren. Verse weefsel is ook makkelijker te vinden in hoofdstuk met behulp van een vibratome wanneer het wordt gekoeld.
3. Snijden weefsel met chirurgische schaar of scalpel in kleine ongeveer 0,5 cm breed en 0,25 cm hoog stukken. Leg weefsel stuks in een gewicht boot of kleine schotel en bedek met ~ 40 ° C gesmolten 4% PBS lage gebufferde smelten agarose. Zorg ervoor dat weefsel in contact met de bodem van de schaal. Duw weefsel stukken als ze zweven. Stollen op het ijs. Dit duurt meestal 3-5 minuten.
4. Vacht vibratome weefsel blok met Loctite lijm. Snij agarose rond weefsel met een scalpel, en vervolgens met behulp van een pincet voorzichtig overdracht van de fragiele agarose ingebed weefsel om een ​​vibratome blok gecoat in lijm. Bewegen niet het stukje weefsel als het eenmaal is ingesteld op het weefsel te blokkeren. Laten drogen ongeveer 10 minuten op ijs.
5. Mount weefsel blok in de vibratome en snijd het weefsel in 200um dikke delen met behulp van een dode langzame voorwaartse snelheid en relatief hoge amplitude. Snelheid en amplitude instellingen variëren per vibratome. Als een vibratome niet beschikbaar is, of weefsel is niet vatbaar is voor vibratome snijden, snij in dunne reepjes weefsel met behulp van een scalpel.
6. Transfer secties met een penseel in een weefsel kamer in het putje van een 24-well weefselkweek plaat met een ml koud PBS-H. Zet maximaal vier weefselcoupes in elk weefsel kamer. Label de deksel van de weefselkweek plaat met experimentele sample informatie en zet het deksel op de plaat met een rubberen band.
7. Als alternatief voor de weefsels die het niet goed gesneden met vibratome, zoals darmen, kunnen snijden zo dun mogelijk strips met scalpel of scheermesje. Zet maar een gedeelte per goed voor scalpel snijden secties.
8. Ga verder met vlekken onmiddellijk na het snijden voltooid weefsels. Houden secties gekoeld tot degradatie te minimaliseren ten alle tijden tot vast. Niet laten delen uitdrogen. Houden secties in gekoelde steriele PBS-H.
9. Incubeer weefselcoupes 's nachts met 0,5 mg / ml FITC-geconjugeerd tetrameren. Kunnen zijn muis of non-konijn antilichamen die zijn gericht op extracellulaire epitopen in deze incubatie, bijv. anti-CD8 antilichamen, verdund 1:200 in het blokkeren van oplossing. Gebruik 1 ml oplossing per goed voor deze en alle volgende incubaties, en het uitvoeren van deze en alle volgende incubaties bij 4 ° C met platen op een schommelende platform. Houd weefsel kamers met verschillende experimentele monsters gescheiden door ten minste een lege goed op kruisbesmetting van oplossingen in de volgende stappen te voorkomen.
10. Na de lagere incubatie, wassen secties met gekoelde PBS-H twee keer (2X) voor 20 minuten elk. Doe dit door de overdracht van het weefsel kamers om een ​​andere 24-well weefselkweek plaat met gekoelde PBS-H. Wees voorzichtig dat u de inhoud druppelen uit een experimentele monster in de andere, bij het verplaatsen van weefsel kamers. Voor alle volgende incubaties en wast dezelfde overdracht het weefsel kamers om een ​​schoon bord met de passende oplossing. Monitor secties in weefsel kamers tijdens de procedure om ervoor te zorgen dat de onderdelen niet vast komen te zitten aan de zijkanten van het weefsel kamers.
11. Fix secties met verse PBS gebufferde 4% paraformaldehyde gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Wassen met koud PBS-H 2X 5 minuten per stuk.
12. Incubeer met konijn anti-FITC antilichamen, bijvoorbeeld Biodesign1: 10.000, in het blokkeren oplossing voor een tot drie dagen. Voor co-etikettering, kunnen niet-konijn antilichamen die zijn gericht op de intracellulaire epitopen in deze incubatie ook. Voor deze optie, bloot epitopen indien nodig en doordringen en blokkeren de cellen voorafgaand aan de tweede incubatie.
13. Als met behulp van antilichamen gericht tegen intracellulaire epitopen die antigen herstel verlangen van formaldehyde fixatie, bloot epitopen door koken 3 keer in 0,01 M ureum, 10 seconden per keer, in een magnetron. Wacht twee minuten tussen elke verwarming. Wees erg voorzichtig als kokende oplossing kan de secties kracht uit de bronnen. Als dit gebeurt, gebruik dan een kwastte duwen gedeelten van de zijkanten van het weefsel kamer of van het deksel van de plaat terug in de bodem van de juiste weefsel kamer. Als antistoffen niet nodig antigen herstel deze stap overslaan.
14. Bij gebruik van antilichamen die zijn gericht op intracellulaire epitopen, voorafgaand aan de tweede incubatie, permeabolize en blokkeren cellen in weefsel secties met PBS-H met 0,3% Triton X-100, en 2% normaal serum geit voor een uur. Vervolgens voert de resterende antilichaam incubaties in PBS-H met 0,3% Triton X-100 en 2% normaal geit serum.
15. Na de tweede incubatie, wassen secties in PBS-H gedurende 20 minuten tot enkele uren. Herhaal dit twee keer voor een totaal van drie wasbeurten. Voer een laatste incubatie met de juiste fluorescent gelabelde antilichamen. Bijvoorbeeld, geit anti-konijn-Cy3 en geit anti-muis-Alexa 488 verdund 1:1000 elk in het blokkeren van oplossing. Incubeer gedurende een tot drie dagen. Houden secties beschermd tegen licht door inpakken van de platen in folie tijdens deze incubatie en daarna, als het licht lest fluoroforen.
16. Was secties in PBS-H gedurende 20 minuten tot enkele uren. Herhaal dit twee keer voor een totaal van drie wasbeurten.
17. Voor IST, gecombineerd met ISH post-fix secties post-fix in 4% paraformaldehyde gedurende 1 uur om veilige tetrameren en antistoffen in de plaats, spoel dan secties met PBS-H opnieuw en monteren.
18. Gebruik een penseel om delen over te dragen aan een microscoopglaasje. Coat elke sectie met glycerol / gelatine bevat 4mg/ml n-propylgallaat of andere montage media die een fluorofoor conserveermiddel en bedek met een dekglaasje aan. Bewaar dia's in het licht beschermde slide container bij -20 °. Spoel weefselkweek borden en verwijder de etiketten op de deksels met alcohol. Kunt hergebruiken platen.
19. Analyseer gekleurde weefselcoupes met een confocale microscoop. Dan kan overgaan tot ISH.

2. Detecteren virus-geïnfecteerde-RNA + cellen door in situ hybridisatie.

Deze in situ hybridisatie protocol werd gewijzigd van onze eerder gepubliceerde protocollen ^4,5 als volgt:

1. Re-cut 5-8-micron-dikke-sectionss van dik in situ tetrameer gekleurde coupes.
   1. 200-micron-dikke-profielen worden verwarmd bij 70 ° C gedurende 5 minuten naar het gedeelte los te maken van de dia.
   2. De sectie wordt dan ingebed in oktober op droog ijs.
   3. 8-micron secties zijn gesneden met een cryostaat van de dikke secties en gehandeld op grond van gesilaniseerd dia's.
   4. Dia's kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C in een gesloten kast voor de daaropvolgende in situ hybridisatie.
2. In situ hybridisatie
   1. Hydrateren weefselcoupes door onderdompeling van dia's voor 3 minuten elk in 90% ethanol en DEPC-behandeld water.
   2. Permeabilize weefselcoupes door verhitting in 10 mM citraat buffer (pH 6,0) bij 98 ° C in een waterbad gedurende 15 minuten.
   3. Cool weefselcoupes bij kamertemperatuur gedurende 20-30 minuten.
   4. Was twee keer in DEPC-behandelde water gedurende 3 minuten.
   5. Acetyleren weefselsectie door onderdompeling van dia's in 0,25% azijnzuuranhydride in 0,1 M TEA (triethanolamine, pH8.0) gedurende 10 minuten.
   6. Overdracht dia's in 0,1 M TEA (pH8.0) gedurende 5 minuten.
   7. Hybridiseren secties ³⁵ S-gelabelde virus-specifieke (zoals HIV-1, SIV) antisense sonde of zin (negatieve controle voor HIV-1, SIV), of ³⁵ S-gelabelde LCMV riboprobes (pooled sense en antisense).
   8. Twee keer wassen secties met 2xSSC gedurende 5 minuten na een nacht hybridisatie bij 42 ° C.
   9. Was secties in STE (0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCL, pH 7,5) gedurende 5 minuten.
   10. Digest secties met RNases A en T1 in STE bij 37 ° C gedurende 30 min
   11. Was secties in 2x SSC plus 50% formamide gedurende 5 minuten.
   12. Was secties in 1x SSC 10 minuten.
   13. Was secties in 0,5 x SSC 15 minuten.
   14. Uitdrogen secties in 70, 80 en 100% ethanol met 0,3 M ammoniumacetaat, die elk 5 minuten.
   15. Coat secties met nucleaire spoor emulsie
   16. Droog in een donkere kamer voor 1 uur.
   17. Expose secties bij 4 ° C voor 11 dag (SIV) en 3 dagen (LCMV).
   18. Ontwikkelen secties in D19 (Kodak, Cat # 146 4593) voor 3 minuten, was u in dH2O 30 seconden vast in Rapid Fixer (Kodak, Cat # 146 4106) voor 4 min, was u in dH2O 5 min x 3 keer.
   19. Uitdrogen in 70%, 80% en absolute ethanol, 5 min per stuk.
   20. Mount dia's in tl-compatibele Permount medium.

3. Acquire confocale microscoop beelden.

1. Vastleggen ISTH beelden met een Bio-Rad MRC 1000 confocale microscoop, of enige andere confocale microscoop met Epi2-Blue Reflection apparaat.
2. Gebruik Epi1-605 voor de rode tetrameer fluorochroom, Epi2-522 DF32 voor de groene CD8 fluorochroom, en de Epi2-Blue Reflection voor zilver korrels (ISH-signaal in de ontwikkelde radioautographs) bij 20x (voor SIV) of 60x (voor LCMV)
3. Sequentieel verzamelen Z-serie beelden op 1-micron intervallen in de drie kanalen van elk veld.
4. Acquire beelden van elke sectie van links naarrechts en van boven naar beneden, en de naam van elk beeld op basis van zijn rij en kolom in een Excel-bestand.
5. Leg elk beeld met een ~ 20% overlap met haar buurlanden beelden om lacunes te voorkomen in de gereconstrueerde montage beeld.

4. Afbeelding analyses: montage beeldreconstructie, cel zwaartepunt berekening en Ruimtelijke analyse.

1. Project Z-serie beelden in een enkel beeld voor elk kanaal met een confocale-assistent (versie 4.02.).
2. Automatisch samen te voegen van het geprojecteerde beeld van de drie kanalen in een RGB-afbeelding met behulp van een Photoshop 7.0 Action procedure.
3. Genereer een montage beeld door stikken samengevoegd beelden samen in lagen in Photoshop 7.0.
4. Associate individueel zilver granen en tetrameer vlek met cellen, en wijs de X-, Y-coördinaten van de centra (hartlijnen) van de SIV RNA + en tetrameer + cellen, met behulp van Metamorph (versie 7.1.3.) Of Photoshop (verkrijgbaar bij de auteur)
5. Exporteren zwaartepunt gegevens in Excel-bestanden als numerieke getallen voor elke cel. E: T ratio's zijn bepaald op basis van de Excel-bestanden van het totale aantal tetrameer + en virale RNA + cellen in de sectie.

Ruimtelijke relaties tussen rood en blauw + tetrameer SIV RNA + cellen worden opgevangen door kopiëren en plakken hun respectievelijke percelen van de Excel-bestanden in een Photoshop-document. Na het verminderen van de dekking van een laag uit te lijnen en de omvang van de roosters, zodat ze samenvallen, kleur-selecteren en kopiëren en plakken in een nieuwe laag de posities van de blauwe RNA +-cellen, en vervolgens weggooien de laag wordt gebruikt om de roosters af te stemmen, de posities van de tetrameer + en virale RNA + cellen zullen worden onthuld in de samengevoegde afbeelding.

5. Aanvullende opmerkingen

Als het snijden infectieus weefsel:

Werk in een BSL2.5 lab. Wees extra voorzorgsmaatregelen met scheermesjes. Leg het scheermes in de vibratome blad monteren met een pincet. Als u het blad niet in met een tang, zet het dan in de voorafgaande aan het toevoegen van weefsel om het bad, en niet in de plaats het blad. Wanneer u klaar bent snijden, verwijdert u het blad met een pincet. Spray blade met 70% EtOH of DMQ voorafgaand aan de verwijdering. Zoals altijd, beschikken over blades in een naaldencontainer. Verandering buitenste handschoenen of spoel in ontsmettingsmiddel na elk contact met besmet weefsel of PBS in de tank. Wanneer u klaar bent, bij het werken met besmet materiaal, voeg DMQ ontsmettingsmiddel aan PBS in de tank zitten en laat een paar minuten voorafgaand aan het verwijderen. Gooi gedecontamineerd PBS in de afvoer. Spoel daarna de tank met water om zout en ontsmettingsmiddel te verwijderen. Schone werkruimte en gebruiksvoorwerpen met DMQ. Spoel gereedschap met water.

Naar Make tetrameren van gebiotinyleerd MHC monomeren:

Verkrijgen gebiotinyleerde MHC klasse I moleculen, zoals HLA-A * 0201 / B ₂ m / peptide moleculen die geproduceerd worden met ofwel Gag (SLYNTVATL), Pol (ILKEPVHGV), of irrelevant MART peptide (ELAGIGILTV) peptiden van Beckman Coulter. Gebiotinyleerde HLA-A * 0301 / B ₂ m / peptide moleculen die geproduceerd worden met ofwel Gag (KIRLRPGGK) of Nef (QVPLRPMTYK) aan de NIAID tetrameer faciliteit. Tetrameren worden gegenereerd door het toevoegen van zes fracties van FITC gelabeld ExtraAvidin (Sigma) op gebiotinyleerd Mamu A * 01 / B ₂ m / peptide monomeren in de loop van 8 uur tot een definitieve molaire verhouding van 4,5:1. De grondgedachte achter het toevoegen van de Extravidin is langzaam, dat tijdens de vroege tijdstippen is er een overvloed aan monomeer die garandeert dat alle van de Extravidin toegevoegd krijgt alle vier gebonden biotine sites. Later in de reactie is dit proces minder efficiënt omdat er minder monomeer links en meer van een kans dat ExtrAvidin niet alle gebonden vier sites hebben. Indien toegevoegd alle ExtrAvidin in een keer de reactie zou zijn minder efficiënt en meer Extravidin moleculen zouden slechts twee of drie monomeren bevestigd.

Discussion

Omdat virus RNA wordt gebruikt als een marker voor virus-geïnfecteerde cellen in dit rapport, moeten alle reagentia voor de hybridisatie worden RNAase vrij. De in situ hybridisatie hier beschreven procedure is aangepast om het fluorescerende signaal van in-situ tetrameer kleuring behouden. Omdat de radioautographic signaal van virus-geïnfecteerde cellen-gedetecteerd door in situ hybridisatie is op een diepte van ongeveer een-cel-diameter, de dikke secties worden gebruikt voor in-situ tetrameer kleuring moeten Recut worden in 5-8-micron dikke secties.

Deze nieuwe techniek van het combineren van in situ tetrameren en in situ hybridisatie (ISTH) hier beschreven maakt gelijktijdig visualisatie, in kaart brengen en analyseren van de ruimtelijke relatie van virus-specifieke CD8 + T-cellen en virus-geïnfecteerde doelcellen. Deze methode kan worden toegepast op CD8 + T-cel-gebaseerde vaccins te evalueren en in andere niet-virus pathogeen en gastheer interacties. De beeldanalyse hier beschreven methode kan ook worden aangepast aan de ruimtelijke relaties van twee-celpopulaties interactie in situ studie, hebben we onlangs bijvoorbeeld het zwaartepunt mapping procedure die wordt gebruikt bij het bestuderen van HIV-1 seksuele overdracht van de niet-menselijke primaat model van simian immune deficiency virusinfectie van rhesus makaken ⁶

Materials

Solutions and Reagents:

PBS-H Phosphate buffered saline containing heparin (100ug/ml or 18.7U/ml) to inhibit RNASes RPMI tissue culture media containing heparin (100ug/ml or 18.7U/ml) to inhibit RNASes 4% low melt agarose in PBS PBS with 2% normal goat serum (or serum from species in which the fluorophore conjugated antibodies were made). PBS with 2% normal goat serum and 0.3% triton X-100 MHC class I tetramers conjugated to FITC Anti-FITC antibodies, e.g. BioDesign rabbit anti-FITC Fluorophore conjugated anti-rabbit IgG that has been highly cross adsorbed to other species IgG for use with multiple labeling, e.g. goat-anti-rabbit-Cy3 Fluorophore conjugated anti-mouse IgG that has been highly cross adsorbed to other species IgG for use with multiple labeling Fresh PBS buffered 4% paraformaldehyde 0.01M Urea Glycerol/gelatin containing 4mg/ml n-propyl gallate

Special equipment

Vibratome Scalpel Razor blades Surgical scissors Loctite Quick Set Instant Adhesive (product # 46551) Forceps #2 camel hair paint brushes. Can trim with razor blade to desired thickness 24-well flat bottomed tissue culture plates e.g. Falcon catalog #353226 Tissue chambers Tin foil Cardboard slide folder e.g. Fisher catalog#12-587-10 Confocal Microscope

IST Reagents Quick Reference

PBS-H (phosphate buffered saline with heparin)

450 ml 1X PBS 50 ml 1X PBS + 10X heparin

1x PBS + 10X heparin

500 ml 1X PBS 500 mg heparin powder (found on dry chemical storage shelf)

PBS-H/ 2% NGS (normal goat serum)

49 ml PBS-H in Falcon tube 1 ml NGS (found in 1 ml aliquots in -20 freezer)

PBS-H/ 2% NGS/ 0.3% Triton X-100

49 ml PBS-H/ 0.3% Triton X-100 in Falcon tube 1 ml NGS (found in 1 ml aliquots in -20 freezer)

PBS-H/ 0.3% Triton X-100

500 ml PBS-H 1.5 ml Triton X-100 (this is a thick liquid found on dry chemical storage shelves)

4% LMP Agarose

2 g LMP agarose powder 50 ml PBS Shake until mixed, microwave until powder dissolves.

GG-NPG (glycerol gelatin with n-propyl galate

Place a bottle of glycerol gelatin in 50 degree water bath to melt Add 0.06 g of propyl galate (found on Terri's shelf), shake well Keep in water bath, shaking occasionally until dissolved. Aliquot into 1 ml tubes (brown tubes)

4% paraformaldehyde

4 g paraformaldehyde powder (found on dry chemical storage shelves) Put about 10 ml PBS-H in a graduated cylinder, add pf powder Add some water until volume reaches about 70 ml Add one dropper of NaOH. Stir until dissolved (usually about 20-30 minutes) Add HCl until pH reaches between 7-8. Bring volume to 100 ml with water.

Urea 0.01 M

0.3 g urea (found on dry chemical storage shelves) 500 ml water