동시에 바이러스 특정 CD8 + T 세포 바이러스에 감염된 세포를 시각화하는 기술 현장에서 Published: August 13, 2009 doi: 10.3791/1561

DOI

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Qingsheng Li¹, Pamela J. Skinner², Lijie Duan¹, Ashley T. Haase¹

¹Department of Microbiology, Medical School, University of Minnesota, ²Department of Veterinary and Biomedical Sciences, University of Minnesota

Summary

현장 tetramer의 얼룩과 현장 하이브리드화 (ISTH)의 결합 기술은 시각화, 매핑 및 분석들은 바이러스에 감염된 대상으로 바이러스에 특정한 CD8 + T 세포의 공간적 근접의 이러한 면역 effectors와 대상 사이의 양적 관계의 결정을 가능하게 감염 결과 수 있습니다.

Abstract

의 숫자와 위치 바이러스 특정 CD8 + 세포들은 감염 대상의 번호와 위치에 상대적인 T 세포가 통관에서 만성 감염 영구 해당 범위의 결과를 결정하는 중요한 것으로 생각됩니다. 우리는 여기서 면역 효과기 (E) 바이러스에 특정한 CD8 + 바이러스에 특정한 CD8 + T 세포를 감지하는 현장 tetramer (인도 표준시) 얼룩에 결합하여 T 세포 감염 대상 (T)이 및 현장 사이의 공간과 양적 관계를 평가하는 방법을 설명 면역 방어 및 감염 사이의 전투가 이루어지는 조직에서 바이러스 - RNA + 세포를 감지하는 하이브 리다이 제이션 (봐야죠). T 비율 : 인도 표준시의 얼룩과 이쉬, 약식 ISTH의 조합이 면역 효과기 세포와 목표, 그리고 E의 손쉬운 결정의 위치의 시각화 및 매핑이 가능합니다. 차례로 이러한 매개 변수는 다음 공간적 근접 사이의 관계를 결정하는 데 사용하고, 초기 감염의 결과를 예측하는 면역 반응의 타이밍과 규모. 수 있습니다

Protocol

이 방법에 보고된 연구에 사용된 리튬 외., 과학 323, 1726년부터 1729년까지 (2009)가 .

현장 tetramer의 얼룩과 현장 하이브리드화 (ISTH) 절차에 결합

ISTH 절차가 4 단계로 나눌 수 있습니다 항원에 특정한 CD8의 1) 인도 표준시의 얼룩 + 조직에서 T 세포 2) 바이러스에 감염된 - RNA + 세포를 감지하는 이쉬, 3) 인도 표준시 - 스테인드 세포와 바이러스 - RNA의 공촛점 현미경 이미징 + 셀, 4) 이미지 분석, 이미지 montages 건설과 tetramer + 및 바이러스 RNA + 세포의 매핑을 포함.

1. 항원에 특정한 CD8의 인도 표준시의 얼룩 + 조직 섹션에서 T 세포.

1. vibratome 또는 메스를 사용하여 200 음 두께 섹션으로 신선한 조직을 잘라.
2. 칠 vibratome의 멸균 PBS - H와 함께 욕조와 0-2로 진정 ° C.는 다소 가파른 27 °로 vibratome 블레이드 각도를 설정합니다. 가능하면 조직이 저하를 최소화하기 위해 얼음에 차게 보관. 신선한 조직도가 차게되면 vibratome를 사용하여 섹션을하는 것이 더 쉽습니다.
3. 외과 가위 또는 0.25 cm 높이 조각으로 작은 약 0.5cm 너비로 메스와 조직을 잘라 버릴거야. 무게는 보트 또는 작은 접시에 조직 조각을 넣고 ° C 녹아 4퍼센트 PBS는 아가로 오스 녹지 낮은 버퍼 ~ 40 커버. 조직은 접시의 바닥과 접촉되어 있는지 확인하십시오. 그들은 부유하면 아래 조직 조각을 밀어. 얼음 고체화. 이것은 일반적으로 3~5분 걸립니다.
4. Loctite의 접착제로 코트 vibratome 조직 블록. 포셉를 사용하여 다음 메스와 함께 조직 주위 아가로 오스 컷 신중하게 접착제로 코팅 vibratome 차단하는 연약한 아가로 오스 임베디드 조직을 전송합니다. 그것이 조직 블록에 설정되면 조직의 조각을 이동하지 마십시오. 얼음 약 10 분 정도 건조 보자.
5. 마운트 조직 vibratome의 블록과 죽은 느린 전진 속도와 상대적으로 높은 진폭을 사용하여 200um 두께 섹션으로 조직을 잘라. 속도와 진폭 설정은 각 vibratome과 다를 수 있습니다. vibratome를 사용할 수없는, 또는 조직 sectioning vibratome 의무되지 않은 경우, 메스를 사용하여 얇은 스트립에 티슈를 잘라.
6. 냉장 PBS - H 1 ML을 포함하는 24 잘 조직 문화 판의 우물에 집합 조직 챔버에 페인트로 섹션을 전송합니다. 각 조직 챔버로 4 조직 섹션에 올려. 고무 밴드와 함께 접시에 실험 샘플 정보 및 보안 뚜껑과 조직 문화 접시의 뚜껑을 라벨.
7. 또는 vibratome 잘 넘어가지 마요 조직을 위해, 뱃속 같은 메스 또는 레이저 블레이드 가능 스트립처럼 얇은 절약하실 수 있습니다. 메스 컷 섹션에 대한 잘마다 하나의 섹션을 넣어.
8. 즉시 완료 후 절단 조직 염색법으로 진행합니다. 고정까지 항상 저하를 최소화하기 위해 냉장 섹션 보관하십시오. 섹션 밖으로 건조시키지 마십시오. 냉장 무균 PBS - H의 섹션을 유지.
9. 0.5 MG / ML FITC 복합 tetramers와 박 이상의 조직이 섹션을 품어. 마우스 또는 솔루션을 차단으로 1:200 희석이 부화에 세포 epitopes, 예를 들어 안티 CD8 항체에서 감독이 아닌 토끼 항체를 포함할 수 있습니다. 이 모든 후속 incubations에 대해 잘 당 1 ML 솔루션을 사용하고, 이것과 4 이후의 모든 incubations ° C 로킹 플랫폼에서 접시와 함께을 수행합니다. 잘 후속 단계에서 솔루션의 교차 오염을 방지하기 위해 비어있는 하나 이상의로 구분하여 여러 실험 샘플을 포함하는 조직 실 보관하십시오.
10. 기본 부화 후 20 분 각 냉장 PBS - H 회 (2X)로 섹션을 씻으십시오. 냉장 PBS - H를 포함하는 다른 24 잘 조직 배양 플레이트에 조직 회의소를 전송하여이 작업을 수행합니다. 한 실험 샘플에서 다른에 내용을 드립하지 않도록주의, 조직 회의소를 이동할 때. 모든 후속 incubations 및 세척을위한 유사하게 해당 솔루션을 포함하고 깨끗한 접시에 조직 챔버 스를 전송할 수 있습니다. 섹션은 조직 챔버의 측면에 집착하지 않도록하기 위해 절차를 수행하는 동안 조직 실에서 섹션을 모니터링합니다.
11. 신선한 PBS로 고정 섹션은 상온에서 2 시간 동안 4 % paraformaldehyde를 버퍼. 차가운 PBS - H 2X 5 분 각 씻으십시오.
12. 1-3일에 대한 솔루션을 차단에서 10000 : 토끼 방지 FITC 항체, 예를 들어 Biodesign1와 부화. 공동 라벨 들어,뿐만 아니라이 부화에 세포 epitopes에서 감독이 아닌 토끼 항체를 포함할 수 있습니다. 이 옵션을 들어, 필요한 경우 epitopes을 폭로하고 침투 사전 번째 배양하는 세포를 차단합니다.
13. 사용하는 항체가 포름 알데히드 고정에서 항원 검색을 필요로 세포 epitopes에서 감독 경우, 전자렌지에 0.01M 요소로 끓고 3 회 10 초 때마다 epitopes을 폭로. 각 가열​​ 사이에 2 분 기다리십시오. 끓는 솔루션 우물의 부분을 강제 수있는 매우주의하십시오. 이런 문제가 발생하면, 페인트 브러쉬를 사용하여조직 챔버의 측면에서 섹션을 추진하거나 다시 적절한 조직 챔버의 바닥에 접시의 뚜껑에서. 항체가 필요하지 않으면 항원 검색이 단계를 생략하십시오.
14. 이전 두 번째 부화하는 세포 epitopes에서 감독 항체를 사용 permeabolize 및 PBS - H 한 시간 트리톤 X - 100과 2퍼센트 정상 염소 혈청 0.3 %를 포함과 함께 조직 부분에서 세포를 차단하십시오. 그렇다면 0.3 % 트리톤 X - 100 2% 정상 염소 혈청을 포함하는 PBS - H에 남아 항체 incubations을 수행합니다.
15. 둘째 부화 후 몇 시간 20 분 동안 PBS - H의 섹션을 씻으십시오. 세 세척 총 두 번 반복합니다. 적절한 찬란 분류 항체와 최종 부화를 수행합니다. 예를 들어, 염소 방지 - 토끼 Cy3와 염소 방지 마우스 알렉사 488이 솔루션을 차단에 1:1000 각 희석. 1-3일위한 부화. 빛을 꺼버리는의 fluorophores으로 이후이 부화하는 동안 주석 박에있는 접시를 포장하고하여 빛으로부터 보호 구역 보관하십시오.
16. 몇 시간 20 분 동안 PBS - H의 섹션을 씻으십시오. 세 세척 총 두 번 반복합니다.
17. 이쉬 후 수정 섹션 장소에 안전 tetramers 및 항체 1 시간 동안 4 % paraformaldehyde에 포스트 수정과 함께 인도 표준시 들어, 다음에 다시와 마운트 PBS - H와 섹션을 씻어.
18. 현미경 슬라이드에 섹션을 전송하는 페인트를 사용하십시오. 글리세롤 / 젤라틴이 포함된 4mg/ml N - 프로필 gallate 또는 coverslip와 형광단의 방부제 및 커버를 포함하는 다른 실장 매체와 문장의 각 섹션을 참조하십시오. 스토어 -20 °에서 조명의 보호 슬라이드 컨테이너에 슬라이드. 조직 문화 접시를 씻어 알코올로 피부에 라벨을 제거합니다. 접시를 재사 용할 수 있습니다.
19. 공촛점 현미경으로 스테인드 조직 섹션을 분석합니다. 다음 이쉬을 진행할 수 있습니다.

2. 현장 하이브 리다이 제이션에 의해 바이러스에 감염된 - RNA + 세포를 감지합니다.

현장 하이브리드화 프로토콜이 다음과 같이 ^4,5의 이전에 게시된 프로토콜에서 바뀌었습니다 :

1. 현장 tetramer 자국이 섹션의 두께에서 다시 절단 5-8 마이크론 두께 - sectionss.
   1. 200 마이크론 두께 - 섹션은 ° C 5 분 슬라이드에서 섹션을 분리하기 위해 70 가열됩니다.
   2. 섹션 다음 드라이 아이스에 대한 OCT에 모두 담겨있다.
   3. 8 미크론 섹션은 두께 섹션에서 그라 이오 스탯로 잘라 슬라이드 silanized을 준수하고 있습니다.
   4. 슬라이드는 ° C 이후의 밀폐된 상자에 원위치 하이브리드화에서 -80에 저장할 수 있습니다.
2. 원위치 하이브리드화에서
   1. 90 % 에탄올과 DEPC - 처리된 물에 3 분, 각 슬라이드를 immersing하여 조직 섹션을 Rehydrate.
   2. ° C 물 목욕 15 분 98시 10mM 구연 산염 버퍼 (산도 6.0)에 가열하여 조직 섹션을 Permeabilize.
   3. 20-30 분 실온에서 시원한 조직 섹션.
   4. 3 분위한 DEPC - 처리된 물에 두 번 씻으십시오.
   5. 10 분 0.1 M 차 (triethanolamine, pH8.0)에 0.25 % 아세트산 무수물에서 슬라이드를 immersing하여 조직 섹션을 Acetylate.
   6. 5 분 0.1 M 차 (pH8.0)에 슬라이드를 전송합니다.
   7. 섹션 ³⁵ S - 표시 바이러스 특정 안티 센스 탐침 또는 감각 (HIV - 1에 대한 부정적인 제어, SIV), 또는 ³⁵ S - 표시 LCMV의 riboprobes (풀링 감각과 안티 센스) (예 : HIV - 1, SIV와 같은).을 잡종
   8. 42 밤새 하이브리드화 후 5 분 2xSSC와 두 섹션을 씻어 ° C.
   9. 5 분 인트에 섹션 (0.5 M NaCL, 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 20 MM 트리스 - HCL, pH를 7.5) 씻으십시오.
   10. 30 분 37 RNases 인트 A와 T1 ° C로 섹션을 다이제스트
   11. 2X SSC의 섹션 플러스 5 분 50 % 포름 아미드 씻으십시오.
   12. 1X SSC 10 분에 섹션을 씻으십시오.
   13. 0.5 X SSC 15 분 섹션을 씻으십시오.
   14. 70 섹션, 80 및 0.3 M의 암모늄 아세테이트, 각 5 분을 포함하는 100 % 에탄올을 탈수.
   15. 핵 트랙 에멀젼과 함께 코트 섹션
   16. 1 시간 동안 어두운 방에서 건조.
   17. 4 섹션을 노출 ° C 11일 (SIV)와 3 일 (LCMV)에 대한.
   18. 3 분 (코닥, 고양이 # 146 4,593) D19에 섹션을 개발 dH2O 30 초 세척, 4 분 (코닥, 고양이 # 146 4106) 신속한 해결사에서 해결, dH2O 5 분 × 3 회 씻는다.
   19. 70 %, 80 % 절대 에탄올, 5 분 각 탈수.
   20. 형광 호환 Permount 매체에 마운트 슬라이드.

3. 공촛점 현미경 이미지를 수집.

1. 바이오 - 래드 MRC 1000 공촛점 현미경, 또는 Epi2 - 블루 반사 장치와 다른 공촛점 현미경으로 ISTH 이미지를 캡처합니다.
2. (LCMV 용) 붉은 tetramer fluorochrome, 더 그린 CD8 fluorochrome에 대한 Epi2 - 522 DF32, 그리고 은색 곡물에 대한 Epi2 - 블루 리플렉션 (개발 radioautographs에 이쉬 신호) 20x에서 (SIV) 또는 60x에 대한 Epi1 - 605을 사용하여
3. 순차적으로 각 필드의 세 채널에서 1 마이크론 간격으로 Z - 시리얼 이미지를 수집합니다.
4. 왼쪽에서 각 섹션에서 이미지를 획득엑셀 파일에 해당 행 및 열에 따라 오른쪽과 아래쪽 맨, 이름과 각 이미지.
5. 복원 몬티지 이미지의 격차를 방지하기 위해 이웃 이미지와 함께 ~ 20 %의 중복 각 이미지를 캡처합니다.

4. 이미지 분석 : 몽타주 이미지 재건, 세포 중심 계산 및 공간적 분석.

1. 공촛점 길잡이 (버전 4.02.) 각 채널에 대해 하나의 이미지로 프로젝트 Z - 시리얼 이미지.
2. 자동으로 포토샵 7.0 작업 절차를 사용하여 하나의 RGB 이미지로 3 채널의 예상 이미지를 병합합니다.
3. 포토샵 7.0에서 레이어에 함께 병합된 이미지를 바느질하여 몽타주 이미지를 생성합니다.
4. 연결 개별 실버 입자와 tetramer는 세포와 얼룩, 그리고 X를 지정, Y는 MetaMorph (버전 7.1.3.) 또는 포토샵을 (저자에서 제공)를 사용하여, SIV RNA +와 tetramer + 세포의 센터 (centroids)의 좌표
5. 각 셀에 대해 숫자 숫자로 Excel 파일에 중심 데이터를 내보냅니다. E : T 비율이 섹션의 tetramer의 총 숫자 +와 바이러스 RNA + 세포에서 Excel 파일에서 결정됩니다.

빨간색과 파란색 tetramer + SIV RNA 사이의 공간적 관계 + 세포는 포토샵 문서에 엑셀 파일에서 각각의 플롯을 복사 및 붙여넣기에 의해 캡처됩니다. 그들이 색상을 선택하고 복사와 푸른 RNA + 세포의 위치 새 레이어에 붙여넣기, 일치 있도록 그리드를 정렬하고 확장할 수있는 레이어의 불투명도 후 그리드를 정렬하는 데 사용 폐기 레이어의 위치를​​ 감소 후 tetramer의 +와 바이러스 RNA의 + 세포는 평평 이미지에 공개됩니다.

5. 추가 정보

감염 조직을 절단하는 경우 :

BSL2.5 연구소에서 작동합니다. 면도날과 특별한 예방 조치를 가져가라. 포셉로 vibratome 블레이드 마운트에 면도칼을 넣어. 당신이 집게로 칼날을 세울 수 없을 경우에는 목욕에 조직을 추가하기 전에 그것을 넣어 칼날을 교체하지 않습니다. 완료 절단 때 집게와 블레이드를 제거합니다. 사전 제거 70 % EtOH 또는 DMQ로 스프레이 블레이드. 언제나처럼, 샵스 컨테이너에 블레이드 처분. 외부 장갑을 변경 또는 조직이나 탱크에 오염된 PBS 각 연락 후 살균제에 린스. 완료되면, 전염성 물질과 함께 일하고있다면, 탱크에 PBS로 DMQ의 살균제를 추가하고 제거하기 전에 몇 분 앉아 보자. 하수구 소독 PBS의 배출. 그런 다음 소금과 살균제를 제거하는 물 탱크를 씻어. DMQ로 클린 작업 공간 및 주방기구. 물을 식기를 씻어.

biotinylated MHC 단량체에서 tetramers을 만들려면 :

나 같은 분자 biotinylated MHC 클래스를 구하는 HLA - A * 0201 / B _2m / 중 개그 (SLYNTVATL) 베크맨 쿨터에서 폴 (ILKEPVHGV) 또는없는 마트 펩타이드 (ELAGIGILTV) 펩티드와 펩티드 분자 생산. Biotinylated HLA - A * 중 개그 (KIRLRPGGK) 또는 NIAID tetramer 시설에서 NEF (QVPLRPMTYK)와 생산된 0301 / B _2m / 펩티드 분자. Tetramers이 분류 FITC 6 aliquots를 추가하여 생성됩니다 biotinylated Mamu에 ExtraAvidin (시그마) * 01 / B _2m / 4.5:1의 마지막 어금니 비율 8 시간 코스 이상의 펩타이드 단량체. Extravidin 추가 뒤에 근거 천천히 초기 시간 지점 동안 Extravidin의 모든 바운드 네 가지 비오틴 사이트를 얻을 수 추가한 보장 모노머의 넘쳐나는있다는 것입니다. ExtrAvidin가 바운드 모든 4 사이트를하지 않을 가능성이 덜 모노머 왼쪽보다가 있기 때문에 나중에 반응으로,이 과정은 덜 효율적이다. 한번에 ExtrAvidin 모두를 추가한 경우 반응은 덜 효율적인 것입니다 더 Extravidin 분자는 2 또는 3 단량체가 첨부된 것이다.

Discussion

바이러스 RNA는이 보고서에서 바이러스에 감염된 세포에 대한 표지로 사용되기 때문에, 하이브리드화하기 전에 모든 시약은 RNAase 무료로해야합니다. 현장 하이브 리다이 제이션 절차는 여기에 설명된은 현장 tetramer의 얼룩에의 형광 신호를 보존하기 위해 수정되었습니다. 현장 하이브 리다이 제이션에 의해 감지된 바이러스에 감염된 세포에서 radioautographic 신호가 한 셀 직경 약의 깊이에 있기 때문에 현장 tetramer의 얼룩에 사용되는 두께 섹션 5 - 8 - 미크론 두께 섹션으로 recut해야합니다.

현장 tetramers 및 현장 하이브리드화 (ISTH)의 결합이 소설 기법은 바이러스에 특정한 CD8 + T 세포와 바이러스 감염 대상 세포의 공간적 관계의 동시 시각화, 매핑 및 분석을 가능하게 여기에서 설명한. 이 방법은 CD8 + T 세포 기반 백신을 평가 적용 및 기타 비 바이러스 병원체 및 호스트 상호 작용 인치 수 있습니다 이미지 분석 방법은 여기에서 설명한 것이 아니라 원래의 장소에 상호 작용하는 두 세포 인구의 공간적 관계를 연구 적용할 수 있습니다, 우리는 최근 유인원 면역 결핍의 nonhuman 영장류 모델에서 HIV - 1 성적 전송의 공부의 중심 매핑 절차를 사용하는 예 붉은 털원숭이의 바이러스 감염 ⁶ 원숭이

Materials

Solutions and Reagents:

PBS-H Phosphate buffered saline containing heparin (100ug/ml or 18.7U/ml) to inhibit RNASes RPMI tissue culture media containing heparin (100ug/ml or 18.7U/ml) to inhibit RNASes 4% low melt agarose in PBS PBS with 2% normal goat serum (or serum from species in which the fluorophore conjugated antibodies were made). PBS with 2% normal goat serum and 0.3% triton X-100 MHC class I tetramers conjugated to FITC Anti-FITC antibodies, e.g. BioDesign rabbit anti-FITC Fluorophore conjugated anti-rabbit IgG that has been highly cross adsorbed to other species IgG for use with multiple labeling, e.g. goat-anti-rabbit-Cy3 Fluorophore conjugated anti-mouse IgG that has been highly cross adsorbed to other species IgG for use with multiple labeling Fresh PBS buffered 4% paraformaldehyde 0.01M Urea Glycerol/gelatin containing 4mg/ml n-propyl gallate

Special equipment

Vibratome Scalpel Razor blades Surgical scissors Loctite Quick Set Instant Adhesive (product # 46551) Forceps #2 camel hair paint brushes. Can trim with razor blade to desired thickness 24-well flat bottomed tissue culture plates e.g. Falcon catalog #353226 Tissue chambers Tin foil Cardboard slide folder e.g. Fisher catalog#12-587-10 Confocal Microscope

IST Reagents Quick Reference

PBS-H (phosphate buffered saline with heparin)

450 ml 1X PBS 50 ml 1X PBS + 10X heparin

1x PBS + 10X heparin

500 ml 1X PBS 500 mg heparin powder (found on dry chemical storage shelf)

PBS-H/ 2% NGS (normal goat serum)

49 ml PBS-H in Falcon tube 1 ml NGS (found in 1 ml aliquots in -20 freezer)

PBS-H/ 2% NGS/ 0.3% Triton X-100

49 ml PBS-H/ 0.3% Triton X-100 in Falcon tube 1 ml NGS (found in 1 ml aliquots in -20 freezer)

PBS-H/ 0.3% Triton X-100

500 ml PBS-H 1.5 ml Triton X-100 (this is a thick liquid found on dry chemical storage shelves)

4% LMP Agarose

2 g LMP agarose powder 50 ml PBS Shake until mixed, microwave until powder dissolves.

GG-NPG (glycerol gelatin with n-propyl galate

Place a bottle of glycerol gelatin in 50 degree water bath to melt Add 0.06 g of propyl galate (found on Terri's shelf), shake well Keep in water bath, shaking occasionally until dissolved. Aliquot into 1 ml tubes (brown tubes)

4% paraformaldehyde

4 g paraformaldehyde powder (found on dry chemical storage shelves) Put about 10 ml PBS-H in a graduated cylinder, add pf powder Add some water until volume reaches about 70 ml Add one dropper of NaOH. Stir until dissolved (usually about 20-30 minutes) Add HCl until pH reaches between 7-8. Bring volume to 100 ml with water.

Urea 0.01 M

0.3 g urea (found on dry chemical storage shelves) 500 ml water