En teknik för att samtidigt Visualisera Virus-Särskilda CD8 + T-celler och virusinfekterade celler In situ Published: August 13, 2009 doi: 10.3791/1561

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Qingsheng Li¹, Pamela J. Skinner², Lijie Duan¹, Ashley T. Haase¹

¹Department of Microbiology, Medical School, University of Minnesota, ²Department of Veterinary and Biomedical Sciences, University of Minnesota

Summary

En teknik som kombinerar in situ tetramer färgning och in situ hybridisering (ISTH) möjliggör visualisering, kartläggning och analys av rumsliga närhet av virus-specifika CD8 + T-celler till deras virusinfekterade mål och fastställande av kvantitativa relationer mellan dessa immun effectors och mål för infektioner resultat.

Abstract

Siffrorna och platser av virus-specifika CD8 + T-celler i förhållande till antal och placering av deras infekterad cell mål är tänkt att vara avgörande för att bestämma resultat som sträcker sig från clearance till kronisk ihållande infektioner. Vi beskriver här en metod för att bedöma den rumsliga och kvantitativa relationer mellan immunsystemets effektorsteg (E)-virus-specifika CD8 + T-celler och infekterade mål (T) som kombinerar in situ tetramer (IST) färgning för att upptäcka virus-specifika CD8 + T-celler och in situ hybridisering (ISH) för att upptäcka virus-RNA + celler i vävnader, där kampen mellan immunförsvaret och infektionen sker. Kombinationen av IST färgning och ISH, förkortat ISTH möjliggör visualisering och kartläggning av platser för effektorceller i immunsystemet och mål, samt facile bestämning av E: T nyckeltal. Dessa parametrar i sin tur kan sedan användas för att bestämma förhållandet mellan rumsliga närhet, och tidpunkten för och omfattningen av immunsvar som förutsäger utfallet i början av infektionen.

Protocol

Denna metod användes i forskningen redovisas i Li et al. Science 323, 1726-1729 (2009) .

Kombinerad in situ tetramer färgning och in situ hybridisering (ISTH) förfaranden

ISTH förfaranden kan delas in i fyra steg: 1) IST färgning av antigen-specifika CD8 + T-celler i vävnader, 2) ISH att påvisa virus-infekterade-RNA + celler, 3) konfokala mikroskopisk avbildning av IST-färgade celler och virus-RNA + celler, 4) bildanalys, inklusive byggande av bilden montage och kartläggning av tetramer + och virus RNA + celler.

1. IST färgning av antigen-specifika CD8 + T-celler i vävnadssnitt.

1. Skär färsk vävnad till 200 um tjocka sektioner med hjälp av en vibratome eller skalpell.
2. Chill vibratome bad med sterilt PBS-H och kyla till 0-2 ° C. Ställ in vibratome bladvinkeln till en ganska brant 27 °. När det är möjligt, hålla vävnader kylda på is för att minimera nedbrytning. Frisk vävnad är också lättare att avsnitt med hjälp av en vibratome när den är kyld.
3. Skär vävnad med kirurgisk sax eller skalpell i små ca 0.5cm bred och 0,25 cm hög bitar. Sätt vävnad bitar i en väga båt eller liten skål och täck med ~ 40 ° C smält 4% PBS buffrad låg smälta agaros. Se till att vävnaden är i kontakt med botten på skålen. Tryck vävnad bitar ner om de flyter. Stelna på is. Detta tar vanligtvis 3-5 minuter.
4. Coat vibratome vävnad block med Loctite lim. Skär agaros runt vävnad med en skalpell och sedan använda en pincett, töm den bräckliga agarosen inbäddad vävnad för att en vibratome blockera belagda med lim. Flytta inte bit vävnad när den är inställd på vävnaden blocket. Låt torka ca 10 minuter på is.
5. Mount vävnad block i vibratome och skär vävnaden i 200um tjocka sektioner med hjälp av en död långsam hastighet framåt och relativt hög amplitud. Hastighet och amplitud inställningarna varierar med varje vibratome. Om en vibratome inte är tillgänglig, eller för vävnad är inte mottaglig för vibratome sektionering, skär vävnader i tunna remsor med hjälp av en skalpell.
6. Överför sektioner med en pensel i ett papper kammare in i brunnen på en 24-såväl vävnadsodling skylt som innehåller 1 ml kyld PBS-H. Sätt upp till fyra vävnadssnitt i varje vävnad kammare. Märk locket på vävnadsodling plattan med experimentella prov information och säkra lock till plattan med ett gummiband.
7. Alternativt, för vävnader som inte skär bra med vibratome, som tarmen, kan skära så tunt som möjligt remsorna med skalpell eller rakblad. Sätt bara ett avsnitt per brunn för skalpell skär sektioner.
8. Fortsätt med färgningen direkt efter avslutad kapning vävnader. Behåll avsnitt kylda för att minimera nedbrytning hela tiden tills fast. Låt inte delar torka. Behåll avsnitt i kylda sterila PBS-H.
9. Inkubera vävnadssnitt över natten med 0,5 mg / ml FITC-konjugerad tetramers. Kan innehålla mus eller icke-kanin antikroppar riktade mot extracellulära epitoper i denna inkubation, t ex anti-CD8 antikroppar, utspädd 1:200 i blockerande lösningen. Använd 1 ml lösning per brunn för denna och alla efterföljande inkubation och utföra denna och alla efterföljande inkubation vid 4 ° C med tallrikar på ett gungande plattform. Håll vävnad kammare som innehåller olika experimentella prov med minst en tom väl för att förhindra korskontaminering av lösningar i efterföljande steg.
10. Efter primär inkubation, tvätta sektioner med kylda PBS-H två gånger (2X) i 20 minuter vardera. Gör detta genom att överföra den vävnad kammare till en annan 24-och vävnadsodling skylt som innehåller kylda PBS-H. Var noga med att inte droppa innehållet från en experimentell provet i en annan, när du flyttar vävnad kammare. För alla efterföljande inkubationer och tvättar på samma sätt överför vävnaden kamrarna till en ren tallrik som innehåller en lämplig lösning. Övervaka avsnitt i vävnaden kammare under förfarandet att se till att sektionerna inte fastnar på sidorna av vävnaden kamrarna.
11. Fix sektioner med färsk PBS buffrad 4% paraformaldehyd i 2 timmar i rumstemperatur. Tvätta med kallt PBS-H-2X 5 min vardera.
12. Inkubera med kanin anti-FITC-antikroppar, t.ex. Biodesign1: 10.000, i blockerande lösningen för en till tre dagar. För co-märkning, kan omfatta icke-kanin antikroppar riktade mot intracellulära epitoper i denna inkubation också. För det här alternativet utsätta epitoper om det behövs och genomsyrar och blockera cellerna innan den andra inkubation.
13. Om du använder antikroppar riktade mot intracellulära epitoper som kräver antigenåtervinning från formaldehyd fixering, utsätta epitoper genom kokning 3 gånger i 0.01M Urea, 10 sekunder varje gång, i en mikrovågsugn. Vänta 2 minuter mellan varje uppvärmning. Var mycket försiktig så kokande lösning kan tvinga avsnitt ur brunnarna. Om detta händer, använd en penselatt driva delar från sidorna av vävnaden kammaren eller från locket på plattan tillbaka till botten av lämplig vävnad kammaren. Om antikroppar inte kräver antigenåtervinning hoppa över detta steg.
14. Om du använder antikroppar riktade mot intracellulära epitoper, före den andra inkubation, permeabolize och blockera celler i vävnadssnitt med PBS-H som innehåller 0,3% Triton X-100, och 2% normal get serum i en timme. Utför sedan kvarvarande antikroppar inkubationer i PBS-H som innehåller 0,3% Triton X-100 och 2% normal get serum.
15. Efter andra inkubation, tvätta delarna i PBS-H i 20 minuter till flera timmar. Upprepa två gånger för totalt tre tvättar. Gör ett sista inkubation med lämpliga fluorescerande antikroppar. Till exempel, get-anti-kanin-Cy3 och get anti-mus-Alexa 488 utspädd 1:1000 vardera i blockerande lösningen. Inkubera i en till tre dagar. Håll delar skyddas från ljus genom att linda plattorna i aluminiumfolie under inkubation och därefter, som ljus släcker fluoroforer.
16. Tvätta delarna i PBS-H i 20 minuter till flera timmar. Upprepa två gånger för totalt tre tvättar.
17. För IST kombination med ISH post-fix sektioner efter fix i 4% paraformaldehyd i 1 timme för att säkra tetramers och antikroppar på plats, skölj sedan delar med PBS-H igen och montera.
18. Använd en pensel för att överföra delar till ett objektglas. Coat varje avsnitt med glycerol / gelatin innehåller 4mg/ml n-propylgallat eller annan montering media som innehåller en fluoroforen konserveringsmedel och täck med ett täckglas. Förvara bilderna i ljus skyddad bild behållare vid -20 °. Skölj plattorna vävnadskultur och ta bort etiketter på lock med alkohol. Kan återanvända plåtar.
19. Analysera färgade vävnadssnitt med en konfokalmikroskop. Sedan kan gå vidare till ISH.

2. Påvisa virus-infekterade-RNA + celler genom in situ hybridisering.

Detta in situ hybridisering protokollet ändrades från vår tidigare publicerade protokoll ^4,5 enligt följande:

1. Re-Klipp 5-8-micron tjock-sectionss från tjocka in situ avsnitt tetramer fläckig.
   1. 200-micron tjock-avsnitten är uppvärmd till 70 ° C i 5 min att lösgöra avsnitt från bilden.
   2. Avsnittet är då inbäddad i oktober på torr is.
   3. 8-micron delar är skurna med en kryostat från den tjocka sektioner och följs silaniseras bilder.
   4. Objektglas kan förvaras vid -80 ° C i en sluten låda för efterföljande in situ hybridisering.
2. In situ hybridisering
   1. Rehydrera vävnadssnitt genom att sänka ner bilderna i 3 min vardera i 90% etanol och DEPC-behandlat vatten.
   2. Permeabilize vävnadssnitt genom uppvärmning i 10 mM citratbuffert (pH 6,0) vid 98 ° C i ett vattenbad under 15 minuter.
   3. Cool vävnadssnitt i rumstemperatur i 20-30 min.
   4. Tvätta två gånger i DEPC-behandlat vatten i 3 min.
   5. Acetylate vävnad avsnitt genom att sänka ned objektglasen i 0,25% ättiksyraanhydrid 0,1 M TEA (trietanolamin, pH8.0) i 10 min.
   6. Överför bilder till 0,1 miljoner TEA (pH8.0) i 5 minuter.
   7. Hybridisera sektioner till ³⁵ S-märkta virus-specifika (som HIV-1, SIV) antisense sond eller känsla (negativ kontroll för HIV-1, SIV), eller ³⁵ S-märkta LCMV riboprobes (poolade förnuft och antisens).
   8. Tvätta sektioner två gånger med 2xSSC i 5 min efter natten hybridisering vid 42 ° C.
   9. Tvätta delarna i Ste (0,5 M NaCl, 1mm EDTA, 20 mM Tris-HCL, pH 7,5) under 5 min.
   10. Digest sektioner med RNaser A och T1 i Ste vid 37 ° C i 30 min
   11. Tvätta avsnitt i 2x SSC plus 50% formamid i 5 min.
   12. Tvätta avsnitt i 1x SSC 10 min.
   13. Tvätta avsnitt i 0,5 x SSC 15 min.
   14. Torka sektioner i 70, 80 och 100% etanol innehållande 0,3 acetat M ammonium, vardera 5 min.
   15. Coat sektioner med kärnvapen spårar emulsion
   16. Torka i ett mörkt rum i 1 timme.
   17. Exponera sektioner vid 4 ° C i 11 dygn (SIV) och 3 dagar (LCMV).
   18. Utveckla avsnitt i D19 (Kodak, Cat # 146 4593) i 3 minuter, tvätta i dH2O 30 sekunder, fixa i Rapid Fixer (Kodak, Cat # 146 4106) i 4 minuter, tvätta i dH2O 5 min x 3 gånger.
   19. Torka i 70%, 80% och absolut etanol, 5 min vardera.
   20. Montera bilder i fluorescerande kompatibla Permount medium.

3. Förvärva konfokalmikroskop bilder.

1. Fånga ISTH bilder med en Bio-Rad MRC 1000 konfokalmikroskop, eller någon annan konfokalmikroskop med Epi2-Blue Reflection enhet.
2. Använd Epi1-605 för de röda tetramer fluorokrom, Epi2-522 DF32 för den gröna CD8 fluorokrom och Epi2-Blå reflektion för silverkorn (ISH signal i den utvecklade radioautographs) på 20x (för SIV) eller 60x (för LCMV)
3. Sekventiellt samla Z-serie bilder på 1-micron mellanrum i tre kanaler för varje fält.
4. Hämta bilder från varje avsnitt från vänster tillhöger och uppifrån och ned, och namnge varje bild i enlighet med dess rad och kolumn i en Excel-fil.
5. Fånga varje bild med en ~ 20% överlappning med grannländerna bilder för att undvika luckor i den rekonstruerade montage bilden.

4. Bild analyser: montage bildrekonstruktion, cell centroiden beräkning och rumslig analys.

1. Projekt Z-serie bilder till en enda bild för varje kanal med Confocal assistent (version 4,02.).
2. Automatiskt sammanfoga den projicerade bilden från tre kanaler in i en RGB-bild med hjälp av en Photoshop 7,0 Action förfarande.
3. Generera en montage bild genom att sy ihop bilderna tillsammans i lager i Photoshop 7.0.
4. Associate enskilda silverkorn och tetramer fläcken med celler, och tilldela X, Y koordinaterna av de centra (centroids) av SIV RNA + och tetramer + celler, med hjälp av metamorfa (version 7.1.3.) Eller Photoshop (kan erhållas från författaren)
5. Exportera centroiden data till Excel-filer som numeriska tal för varje cell. E: T nyckeltal bestäms utifrån de Excel-filer från det totala antalet tetramer + och RNA + celler i avsnittet.

Rumsliga relationer mellan röda tetramer + och blå SIV RNA + celler fångas genom att kopiera och klistra in sina respektive tomter från Excel-filer till ett Photoshop-dokument. Efter att ha minskat opaciteten för ett lager för att anpassa och skala näten så att de sammanfaller, färg-välja och kopiera och klistra in i ett nytt lager positionerna för den blå RNA + celler, och sedan kasta lagret används för att justera nät, positionerna av tetramer + och viralt RNA + kommer cellerna att avslöjas i den tillplattade bilden.

5. Ytterligare anmärkningar

Om kapning smittsamma vävnad:

Arbeta i en BSL2.5 labb. Vidta särskilda försiktighetsåtgärder med rakblad. Sätt rakkniv i vibratome bladet fästet med en tång. Om du inte kan lägga bladet i med en pincett, sedan lägga den i innan du lägger vävnad till badet, och ersätter inte bladet. När du är klar skär du bort blad med en pincett. Spray blad med 70% EtOH eller DMQ före bortförandet. Som alltid förfoga över bladen i en avfallsbehållare. Ändra yttre handskar eller skölj i desinfektionsmedel efter varje kontakt med vävnad eller förorenade PBS i tanken. När du är klar, om att arbeta med infektiöst material, lägga DMQ desinfektionsmedel till PBS i tanken och låt sitta ett par minuter innan du tar bort. Kasta sanerat PBS i avloppet. Skölj sedan tanken med vatten för att avlägsna salt och desinfektionsmedel. Rengör arbetsytor och redskap med DMQ. Skölj redskap med vatten.

Att tjäna tetramers från biotinylerad MHC monomerer:

Skaffa biotinylerad MHC klass I molekyler som HLA-A * 0201 / B ₂ m / peptid molekyler som produceras med antingen Gag (SLYNTVATL), Pol (ILKEPVHGV) eller irrelevanta MART peptid (ELAGIGILTV) peptider från Beckman Coulter. Biotinylerad HLA-A * 0301 / B ₂ m / molekyler peptid produceras med antingen Gag (KIRLRPGGK) eller NEF (QVPLRPMTYK) vid NIAID tetramer anläggningen. Tetramers genereras genom att lägga till 6 portioner av FITC-märkt ExtraAvidin (Sigma) så biotinylerad Mamu A * 01 / B ₂ m / peptid monomerer under loppet av 8 timmar till en slutlig molförhållandet mellan 4,5:1. Tanken bakom att lägga till Extravidin långsamt att under den tidiga tidpunkter det finns ett överflöd av monomer som försäkrar att alla Extravidin läggas får alla fyra biotin bunden webbplatser. Senare i reaktionen är denna process mindre effektiv eftersom det finns mindre monomer vänster och mer av en chans att ExtrAvidin inte kommer att ha alla fyra bundna webbplatser. Om lagt till alla ExtrAvidin på en gång reaktionen skulle bli mindre effektiv och mer Extravidin molekyler skulle endast ha 2 eller 3 monomerer bifogas.

Discussion

Eftersom virus RNA används som en markör för virusinfekterade celler i denna rapport skall alla reagenser innan hybridisering vara RNAase gratis. In situ hybridisering som beskrivs här har ändrats för att bevara den fluorescerande signalen från in situ tetramer färgning. Eftersom radioautographic signalen från virusinfekterade-celler detekteras med in situ hybridisering är på ett djup av cirka en cell diameter, den tjocka sektioner som används för in situ tetramer färgning måste skäras i 5-8-micron tjock sektioner.

Denna nya teknik för att kombinera på plats tetramers och in situ hybridisering (ISTH) beskrivs här för simultan visualisering, kartläggning och analys av rumsliga förhållandet mellan virus-specifika CD8 + T-celler och virus-infekterade celler. Denna metod kan användas för att utvärdera CD8 + T celler baserat vaccin och andra icke-virus patogen och interaktioner värd. Bilden analysmetod som beskrivs här även kan anpassas för att studera rumsliga relationer av två cellpopulationer interagerar in situ, t ex vi nyligen använde centroiden kartläggning procedur för att studera av HIV-1 sexuell överföring i icke-mänskliga primater modell av apliknande immunbrist virusinfektion av rhesus makaker ⁶

Materials

Solutions and Reagents:

PBS-H Phosphate buffered saline containing heparin (100ug/ml or 18.7U/ml) to inhibit RNASes RPMI tissue culture media containing heparin (100ug/ml or 18.7U/ml) to inhibit RNASes 4% low melt agarose in PBS PBS with 2% normal goat serum (or serum from species in which the fluorophore conjugated antibodies were made). PBS with 2% normal goat serum and 0.3% triton X-100 MHC class I tetramers conjugated to FITC Anti-FITC antibodies, e.g. BioDesign rabbit anti-FITC Fluorophore conjugated anti-rabbit IgG that has been highly cross adsorbed to other species IgG for use with multiple labeling, e.g. goat-anti-rabbit-Cy3 Fluorophore conjugated anti-mouse IgG that has been highly cross adsorbed to other species IgG for use with multiple labeling Fresh PBS buffered 4% paraformaldehyde 0.01M Urea Glycerol/gelatin containing 4mg/ml n-propyl gallate

Special equipment

Vibratome Scalpel Razor blades Surgical scissors Loctite Quick Set Instant Adhesive (product # 46551) Forceps #2 camel hair paint brushes. Can trim with razor blade to desired thickness 24-well flat bottomed tissue culture plates e.g. Falcon catalog #353226 Tissue chambers Tin foil Cardboard slide folder e.g. Fisher catalog#12-587-10 Confocal Microscope

IST Reagents Quick Reference

PBS-H (phosphate buffered saline with heparin)

450 ml 1X PBS 50 ml 1X PBS + 10X heparin

1x PBS + 10X heparin

500 ml 1X PBS 500 mg heparin powder (found on dry chemical storage shelf)

PBS-H/ 2% NGS (normal goat serum)

49 ml PBS-H in Falcon tube 1 ml NGS (found in 1 ml aliquots in -20 freezer)

PBS-H/ 2% NGS/ 0.3% Triton X-100

49 ml PBS-H/ 0.3% Triton X-100 in Falcon tube 1 ml NGS (found in 1 ml aliquots in -20 freezer)

PBS-H/ 0.3% Triton X-100

500 ml PBS-H 1.5 ml Triton X-100 (this is a thick liquid found on dry chemical storage shelves)

4% LMP Agarose

2 g LMP agarose powder 50 ml PBS Shake until mixed, microwave until powder dissolves.

GG-NPG (glycerol gelatin with n-propyl galate

Place a bottle of glycerol gelatin in 50 degree water bath to melt Add 0.06 g of propyl galate (found on Terri's shelf), shake well Keep in water bath, shaking occasionally until dissolved. Aliquot into 1 ml tubes (brown tubes)

4% paraformaldehyde

4 g paraformaldehyde powder (found on dry chemical storage shelves) Put about 10 ml PBS-H in a graduated cylinder, add pf powder Add some water until volume reaches about 70 ml Add one dropper of NaOH. Stir until dissolved (usually about 20-30 minutes) Add HCl until pH reaches between 7-8. Bring volume to 100 ml with water.

Urea 0.01 M

0.3 g urea (found on dry chemical storage shelves) 500 ml water