Summary
Une technique combinant la coloration tétramère situ et l'hybridation in situ (ISTH) permet la visualisation, la cartographie et l'analyse de la proximité spatiale des virus spécifiques des cellules T CD8 + à leurs infectées par le virus cibles, et la détermination des relations quantitatives entre ces effecteurs du système immunitaire et les cibles aux résultats de l'infection.
Abstract
Le nombre et les emplacements spécifiques du virus cellules T CD8 + par rapport au nombre et l'emplacement de leurs cibles cellulaires infectées est pensé pour être critique dans la détermination des résultats qui vont de l'autorisation d'infections chroniques persistantes. Nous décrivons ici une méthode pour évaluer les relations spatiales et quantitatives entre immunitaires effectrices (E) spécifiques du virus de cellules T CD8 + et les cibles infectées (T) qui combine in situ tétramère (TSI) de coloration pour la détection spécifique du virus de cellules T CD8 + et in situ l'hybridation (ISH) pour détecter les virus-ARN + cellules dans les tissus où la bataille entre les défenses immunitaires et l'infection a lieu. La combinaison de la coloration IST et ISH, en abrégé l'ISTH, permet la visualisation et de cartographie des emplacements des cellules immunitaires effectrices et cibles faciles et à la détermination de E: T ratios. Ces paramètres à leur tour peuvent ensuite être utilisées pour déterminer les relations entre la proximité spatiale, et le timing et l'ampleur de la réponse immunitaire qui permettent de prédire les résultats en début d'infection.
Protocol
Cette méthode a été utilisée dans la recherche présentée dans Li et al., Science 323, 1726-1729 (2009) .
Combiné à la coloration tétramère situ et in situ d'hybridation (ISTH) des procédures
Coloration TSI 1) de l'antigène spécifique cellules T CD8 + dans les tissus; 2) ISH pour détecter infectées par le virus-ARN + cellules, 3) l'imagerie confocale microscopique des IST cellules colorées et virales ARN +: procédures ISTH peut être divisé en 4 étapes cellules; 4) l'analyse d'images, y compris la construction des montages d'images et la cartographie des tétramère + et un virus à ARN + cellules.
1. Coloration des IST spécifiques de l'antigène T CD8 + dans les coupes de tissus.
- Couper les tissus frais dans 200 um d'épaisseur des sections en utilisant un vibratome ou un scalpel.
- Réfrigérer vibratome bain avec du PBS stérile et chill-H à 0-2 ° C. Régler l'angle des pales vibratome à un 27 assez raide °. Autant que possible, de garder les tissus refroidis sur la glace afin de minimiser la dégradation. Les tissus frais est également plus facile à l'aide d'une section vibratome quand il est refroidi.
- Coupez le tissu avec des ciseaux ou un scalpel chirurgical en petits gamme d'environ 0.5cm par des morceaux cm 0,25 de haut. Mettez les morceaux de tissus dans un bateau peser ou petit plat et couvrir avec ~ 40 ° C fondu 4% PBS tamponné peu fondre l'agarose. Assurez-vous que le tissu est en contact avec le fond du plat. Poussez les morceaux de tissu vers le bas si ils flottent. Solidifier sur la glace. Cela prend généralement 3-5 minutes.
- Manteau de bloc de tissu avec de la colle Loctite vibratome. Couper agarose autour du tissu avec un scalpel, puis en utilisant une pince, transférer soigneusement le tissu fragile agarose intégrés à un bloc vibratome recouvert de colle. Ne déplacez pas le morceau de tissu une fois qu'il est fixé sur le bloc de tissu. Laisser sécher environ 10 minutes sur la glace.
- Bloc de tissu dans le mont vibratome et couper le tissu dans les sections épaisses 200um en utilisant une vitesse lente morte avant et d'amplitude relativement élevée. Les réglages de vitesse et l'amplitude varie avec chaque vibratome. Si un vibratome n'est pas disponible, ou le tissu ne se prête pas aux vibratome sectionnement, couper les tissus en fines lanières à l'aide d'un scalpel.
- Transfert des sections avec un pinceau dans une chambre de tissus fixés dans le puits d'une plaque de 24 puits de culture de tissu contenant 1 ml de PBS refroidi-H. Mettez un maximum de quatre sections de tissu dans chaque chambre des tissus. Étiquetez le couvercle de la plaque de culture tissulaire avec des informations échantillon expérimental et verrouiller le couvercle à la plaque avec une bande élastique.
- Sinon, pour les tissus qui ne sont pas coupés bien avec vibratome, comme l'intestin, peut couper aussi fine que possible avec des bandes lame de scalpel ou un rasoir. Mettez une seule section par puits pour les sections coupées scalpel.
- Procéder à une coloration des tissus finis immédiatement après la coupe. Gardez sections réfrigérées pour minimiser la dégradation en tout temps jusqu'à fixe. Ne laissez pas sécher les sections. Gardez sections réfrigérées PBS stérile-H.
- Incuber les coupes de tissus pendant une nuit avec 0,5 mg / ml FITC conjugué tétramères. Peut inclure des souris ou de lapin non-anticorps dirigés au épitopes extracellulaires de cette incubation, par exemple, anticorps anti-CD8, dilué 1:200 dans une solution de blocage. Utiliser 1 ml de solution par puits pour cela, et toutes les incubations ultérieures, et d'effectuer cela et toutes les incubations ultérieures à 4 ° C avec des plaques sur une plateforme à bascule. Gardez chambres de tissu contenant différents échantillons expérimentaux séparés par au moins un puits vide pour éviter la contamination croisée de solutions dans les étapes ultérieures.
- Après une incubation primaire, lavez sections avec PBS refroidi-H deux fois (2X) pendant 20 minutes chacun. Pour ce faire, en transférant les chambres de tissu à un autre de 24 puits plaque de culture tissulaire contenant du PBS refroidi-H. Attention à ne pas goutte à goutte le contenu d'un échantillon expérimental dans un autre, lors du déplacement chambres de tissu. Pour toutes les incubations et les lavages ultérieurs de la même transférer les chambres de tissu à une assiette propre contenant la solution appropriée. Moniteur sections dans les chambres des tissus pendant la procédure pour s'assurer que les articles ne restez pas coincé sur les côtés de la chambre des tissus.
- Sections Fix avec du PBS frais tamponné paraformaldéhyde à 4% pendant 2 heures à température ambiante. Laver avec du PBS froid-H 2x 5 min chacune.
- Incuber de lapin anti-FITC anticorps, par exemple Biodesign1: 10000, dans une solution de blocage pendant un à trois jours. Pour la co-marquage, peuvent inclure non-lapin des anticorps dirigés au épitopes intracellulaires dans cette incubation ainsi. Pour cette option, d'exposer des épitopes si nécessaire et le perméat et de bloquer les cellules avant la seconde incubation.
- Si aide d'anticorps dirigés au épitopes intracellulaires qui nécessitent récupération d'antigène de la fixation de formaldéhyde, d'exposer des épitopes en faisant bouillir 3 fois en urée 0,01 M, 10 secondes à chaque fois, dans un four à micro-ondes. Attendre 2 minutes entre chaque chauffage. Soyez très prudent tant que solution bouillante peut forcer les sections hors des puits. Si cela se produit, utilisez un pinceaupour pousser les sections sur les côtés de la chambre de tissu ou du couvercle de la plaque arrière dans le fond de la chambre de tissu approprié. Si des anticorps n'ont pas besoin de récupération d'antigène omettre cette étape.
- Si utilisant des anticorps dirigés au épitopes intracellulaires, avant la seconde incubation, permeabolize et bloquer les cellules dans des coupes de tissus avec du PBS-H contenant 0,3% Triton X-100, et 2% de sérum de chèvre normal pendant une heure. Effectuez ensuite les incubations d'anticorps restant dans du PBS-H contenant 0,3% de Triton X-100 et du sérum de chèvre normal à 2%.
- Après une incubation de seconde, se laver les sections en PBS-H pendant 20 minutes à plusieurs heures. Répéter deux fois pour un total de trois lavages. Effectuer une incubation finale avec les anticorps appropriés marqués par fluorescence. Par exemple, de chèvre anti-lapin-Cy3 et chèvre anti-souris-Alexa 488 dilué 1:1000 chacun dans une solution de blocage. Incuber pendant un à trois jours. Gardez sections protégées de la lumière en enveloppant les plaques dans une feuille d'étain pendant cette incubation et par la suite, comme fluorophores désaltère lumière.
- Lavez sections en PBS-H pendant 20 minutes à plusieurs heures. Répéter deux fois pour un total de trois lavages.
- Pour TSI combiné avec l'ISH de post-correction des sections post-fixer dans du paraformaldéhyde 4% pendant 1 heure pour sécuriser tétramères et d'anticorps en place, puis rincer avec PBS-sections H et monter à nouveau.
- Utilisez un pinceau pour transférer des sections d'une lame de microscope. Enrober chaque section avec glycérol / gélatine contenant 4mg/ml n-propyle gallate ou d'autres supports de montage contenant un conservateur fluorophore et couvrir avec une lamelle. Diapositives Conserver dans un récipient glisser la lumière protégés à -20 °. Rincer les plaques de culture de tissus et enlever les étiquettes sur les couvercles avec de l'alcool. Pouvez réutiliser les plaques.
- Analyser des coupes de tissus colorés avec un microscope confocal. Puis peut procéder à l'ISH.
2. Détecter infectées par le virus-ARN + cellules par hybridation in situ.
Cette hybridation in situ dans le protocole a été modifié par nos protocoles publiés antérieurement 4,5 comme suit:
- Recoupez 5-8-micron d'épaisseur-sectionss d'épaisseur in situ coupes colorées tétramère.
- 200 microns d'épaisseur des sections sont chauffés à 70 ° C pendant 5 min pour détacher la section de la diapositive.
- La section est ensuite intégré dans les PTOM sur glace sèche.
- 8 microns sections sont coupés avec un cryostat à partir des sections épaisses et respectées diapositives silanisé.
- Les diapositives peuvent être conservés à -80 ° C dans une boîte scellée pour subséquentes hybridation in situ.
- Hybridation in situ
- Réhydrater des coupes de tissus en immergeant les lames pendant 3 minutes dans chacune des éthanol à 90% et DEPC eau traitée.
- Perméabiliser des coupes de tissus par chauffage dans un tampon citrate 10mM (pH 6,0) à 98 ° C dans un bain-marie pendant 15 min.
- Coupes de tissus refroidir à température ambiante pendant 20-30 min.
- Laver deux fois dans l'eau traitée par DEPC pendant 3 min.
- Acétyler coupe de tissu en immergeant glisse dans l'anhydride acétique 0,25% dans 0,1 M de TEA (triéthanolamine, pH 8,0) pendant 10 min.
- Transfert glisse dans 0,1 M TEA (pH 8,0) pendant 5 min.
- Hybrider sections à 35 S-étiquetés spécifiques du virus (comme le VIH-1, SIV) sonde antisens ou sens (contrôle négatif pour le VIH-1, SIV), ou 35 S-étiquetés ribosondes LCMV (sens commun et antisens).
- Laver deux fois avec des sections 2xSSC pendant 5 min après hybridation nuit à 42 ° C.
- Lavez sections à STE (0,5 M de NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCL, pH 7,5) pendant 5 min.
- Recueil des sections avec des RNases A et T1 à STE à 37 ° C pendant 30 min
- Lavez sections dans 2x SSC, plus 50% de formamide pendant 5 min.
- Lavez sections dans 1x SSC 10 min.
- Lavez sections en 0,5 x SSC 15 min.
- Déshydrater sections 70, 80 et 100% d'éthanol contenant 0,3 M d'acétate d'ammonium, chaque 5 min.
- Manteau sections avec l'émulsion de traces nucléaires
- Sec dans une pièce sombre pendant 1 heure.
- Exposer des sections à 4 ° C pour 11 jours (SIV) et 3 jours (LCMV).
- Développer sections D19 (Kodak, Cat # 146 4593) pendant 3 min, laver à l'dH2O 30 secondes, fixer dans le fixateur rapide (Kodak, Cat # 146 4106) pendant 4 min, laver à l'dH2O 5 min x 3 fois.
- Déshydrater dans 70%, 80% et d'éthanol absolu, à 5 min chacune.
- Diapositives mont de fluorescence moyenne Permount compatibles.
3. Acquérir les images microscope confocal.
- Capturez des images avec un microscope ISTH Bio-Rad 1000 MRC confocale, ou tout autre microscope confocal avec dispositif de réflexion Epi2-Bleu.
- Utilisez Epi1-605 pour le fluorochrome rouge tétramère, Epi2 DF32-522 pour le vert fluorochrome CD8, et la réflexion Epi2-Bleu pour les grains d'argent (signal ISH dans le radioautographs développés) à 20x (pour SIV) ou 60x (pour LCMV)
- Séquentiellement collecter des Z-série d'images à des intervalles de 1 micron dans les trois canaux de chaque champ.
- Acquérir les images de chaque section de gauche àimage de droite et de haut en bas, et le nom de chacun selon son rang et de colonne dans un fichier Excel.
- Capturez chaque image avec un chevauchement ~ 20% avec ses images voisines pour éviter des lacunes dans l'image reconstruite montage.
4. Analyses Image: Montage de reconstruction d'image, calcul de cellule centroïde et l'analyse spatiale.
- Projet Z-série d'images en une seule image pour chaque canal avec l'assistant confocale (version 4.02)..
- Fusionner automatiquement l'image projetée à partir de trois canaux dans une image RVB, en utilisant une procédure d'action de Photoshop 7.0.
- Générer une image montage par piquage des images fusionnées en couches dans Photoshop 7.0.
- Associé grains d'argent individuelle et tétramère tache avec les cellules, et assigner les coordonnées X, Y des centres (centroïdes) de l'ARN et + SIV tétramère cellules +, en utilisant MetaMorph (version 7.1.3.) Ou Photoshop (disponible auprès de l'auteur)
- Exporter des données dans des fichiers Excel centroïde que les numéros numérique pour chaque cellule. E: T ratios sont déterminés à partir des fichiers Excel à partir du nombre total de tétramère + + et l'ARN viral des cellules dans la section.
Les relations spatiales entre le rouge et le bleu tétramère + SIV ARN des cellules + sont capturées en copiant et collant leurs parcelles respectives à partir des fichiers Excel dans un document Photoshop. Après avoir diminué l'opacité d'un calque d'aligner et de l'échelle les grilles de sorte qu'ils coïncident, couleur sélectionner et copier et coller dans un nouveau calque les positions des bleus ARN + cellules, puis jeter la couche utilisée pour aligner les grilles, les positions de l'+ tétramère et l'ARN viral + cellules sera révélé dans l'image aplatie.
5. Notes complémentaires
Si l'on coupe des tissus infectieux:
Travailler dans un laboratoire BSL2.5. Prenez des précautions particulières avec des lames de rasoir. Mettez le rasoir dans la lame vibratome monter avec une pince. Si vous ne pouvez pas mettre la lame avec une pince, puis le mettre dans le tissu avant d'ajouter au bain, et ne pas remplacer la lame. Lors de la coupe terminée, retirez la lame avec une pince. Vaporiser la lame avec 70% EtOH ou DMQ avant leur enlèvement. Comme toujours, disposer des lames dans un contenant pour objets pointus. Changer de gants extérieure ou rincer dans une solution désinfectante après chaque contact avec un tissu ou contaminés PBS dans le réservoir. Lorsque vous avez terminé, si l'on travaille avec du matériel infectieux, ajouter de désinfectant DMQ à PBS dans le réservoir et laisser reposer quelques minutes avant de retirer. Eliminer décontaminés PBS dans le drain. Puis rincez le réservoir avec de l'eau pour enlever le sel et le désinfectant. Espace de travail propre et les ustensiles avec DMQ. Rincer les ustensiles avec de l'eau.
Faire des tétramères CMH biotinylé monomères:
Obtenir biotinylé molécules CMH de classe I tels que HLA-A * 0201 / B 2 m / molécules peptidiques produites soit avec Gag (SLYNTVATL), Pol (ILKEPVHGV), ou sans rapport MART peptide (ELAGIGILTV) les peptides de Beckman Coulter. Biotinylé HLA-A * 0301 / B 2 m / molécules peptidiques produites soit avec Gag (KIRLRPGGK) ou NEF (QVPLRPMTYK) à l'installation tétramère NIAID. Tétramères sont générés en ajoutant 6 aliquotes de FITC étiqueté ExtraAvidin (Sigma) pour biotinylé Mamu A. * 01 / B 2 m / monomères peptidiques au cours de 8 heures à un rapport molaire final de 4,5:1 Le raisonnement derrière ajoutant le extravidine est lentement que durant les points de temps au début il ya une surabondance de monomère qui assure que toutes les extravidine ajouté obtient les quatre sites biotine lié. Plus tard dans la réaction, ce processus est moins efficace car il ya moins de monomère à gauche et plus d'une chance que extravidine n'auront pas tous les 4 sites liés. Si elles sont ajoutées tous les extravidine à la fois la réaction serait moins efficace et plus molécules extravidine aurait seulement 2 ou 3 monomères ci-joint.
Discussion
Depuis l'ARN du virus est utilisé comme marqueur pour les cellules infectées par le virus dans ce rapport, tous les réactifs avant l'hybridation doit être ARNase libre. L'hybridation in situ dans la procédure décrite ici a été modifié pour préserver le signal fluorescent à partir de la coloration tétramère situ. Comme le signal d'radioautographic infectées par le virus-cellules détectées par hybridation in situ est à une profondeur d'environ un diamètre de cellules, les sections d'épaisseur utilisé pour la coloration tétramère situ doivent être recoupées dans les 5-8-micron d'épaisseur des sections.
Cette nouvelle technique de combiner dans tétramères situ et l'hybridation in situ (ISTH) a décrit ici permet la visualisation simultanée, la cartographie et l'analyse de la relation spatiale des cellules spécifiques du virus de CD8 + T et les cellules infectées cible. Cette méthode peut être appliquée pour évaluer le vaccin CD8 + T à base de cellules et dans d'autres non-virus pathogène et interactions hôte. La méthode d'analyse d'image décrites ici peuvent également être adaptées pour étudier les relations spatiales des populations à deux cellules en interaction in situ, par exemple, nous avons récemment utilisé la procédure de cartographie centroïde dans l'étude du VIH-1 transmission sexuelle dans le modèle primate non humain d'immunodéficience simienne infection par le virus de macaques rhésus 6
Acknowledgments
Nous remercions J. Sedgewick d'assistance dans la mise en place du microscope confocal pour capturer des images de grains d'argent; Soutenu en partie par des subventions de recherche du NIH AI48484 (ATH), AI20048 (RA), et AI066314 (CJM); Centre National de Recherche Ressources subvention. RR00169 (CNPRC, University of California, Davis).
Materials
Solutions and Reagents: |
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Special equipment |
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IST Reagents Quick Reference |
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PBS-H (phosphate buffered saline with heparin) |
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1x PBS + 10X heparin |
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PBS-H/ 2% NGS (normal goat serum) |
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PBS-H/ 2% NGS/ 0.3% Triton X-100 |
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PBS-H/ 0.3% Triton X-100 |
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4% LMP Agarose |
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GG-NPG (glycerol gelatin with n-propyl galate |
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4% paraformaldehyde |
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Urea 0.01 M |
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References
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