Summary
Техника объединения на месте окрашивания тетрамера и гибридизация (ISTH) позволяет визуализации, отображения и анализа пространственной близости вирус-специфических CD8 + Т-клеток с их инфицированных вирусом цели, а также определение количественных соотношений между этими иммунных эффекторов и задач к инфекции результатов.
Abstract
Количества и местонахождения вирус-специфических CD8 + T-клеток относительно количества и местонахождения их инфицированных цели ячейка считается критическим для определения результатов, которые варьируются от оформления к хроническому стойких инфекций. Мы опишем здесь метод оценки пространственных и количественных соотношений между иммунной эффекторной (E) вирус-специфических CD8 + Т-клеток и инфицированных мишеней (Т), которая объединяет на месте тетрамер (IST) окрашивания для выявления вирус-специфических CD8 + T-клеток и на месте гибридизация (МОГ) для обнаружения вирусной РНК +-клеток в тканях, где сражение между иммунной и инфекция имеет место. Сочетание окрашивания IST и ISH, сокращенно ISTH, дает возможность визуализации и отображения местах иммунных клеток-эффекторов и задач, а поверхностное определение E: T отношений. Эти параметры в свою очередь, могут быть использованы для определения отношений между пространственной близости, а также сроки и величина иммунного ответа, что предсказать результаты в начале инфекции.
Protocol
Этот метод был использован в исследованиях сообщается в Li и соавт., 323 Наука, 1726-1729 (2009) .
Комбинированное на месте окрашивания тетрамера и гибридизация (ISTH) процедуры
ISTH процедуры можно разделить на 4 этапа: 1) IST окрашивание антиген-специфических CD8 + T-клеток в тканях, 2) ISH для выявления инфицированных вирусом-РНК + клеток, 3) конфокальной микроскопических изображений IST-окрашенных клеток и вирусной РНК + клетки, 4) анализ изображений, в том числе строительство изображение монтажи и картирование тетрамер + и вирусной РНК + клеток.
1. IST окрашивание антиген-специфических CD8 + Т-клеток в срезах тканей.
- Cut свежих тканей в 200 мкм разделы, используя vibratome или скальпелем.
- Холод vibratome ванна с стерильной PBS-H и охладить до 0-2 ° С. Установите vibratome углом лезвие довольно крутой 27 °. По возможности, держите тканей охлажденной на льду, чтобы минимизировать деградацию. Свежая ткань также легче секции, используя vibratome, когда она охлаждается.
- Отрежьте ткань с хирургическим скальпелем или ножницами на мелкие примерно 0,5 см в ширину и 0,25 см высотой штук. Положите ткань штук в весят лодке или маленькое блюдо и накрыть ~ 40 ° C расплавленный 4% PBS буфере низкой расплава агарозы. Убедитесь, что ткань находится в контакте с нижней части блюда. Нажмите ткани частей вниз, если они плавают. Укрепить на льду. Это обычно занимает 3-5 минут.
- Пальто vibratome ткани блок клеем Loctite. Вырезать агарозном вокруг ткани скальпелем, а затем с помощью щипцов, тщательно передачи хрупкой агарозном встроенных ткани vibratome блока покрыты клеем. Не перемещайте кусочек ткани, когда он будет установлен на ткани блока. Дайте высохнуть около 10 минут на льду.
- Горы ткани блока в vibratome и сократить ткани в 200um толстым слоем использованием мертвых медленным поступательной скорости и относительно высокой амплитудой. Скорость и амплитуда настройки изменяются с каждой vibratome. Если vibratome недоступен, или ткани, не поддается vibratome секционирования, вырезать тканей на тонкие полоски с помощью скальпеля.
- Передача участков с кистью в ткани камеры установлены в скважине 24-и культуре ткани пластину, содержащую 1 мл охлажденной PBS-H. Положите до четырех разделов ткани в каждой ткани камеры. Этикетка крышки пластины тканевой культуры с экспериментальной информации образца и безопасной крышкой, чтобы пластина с резинкой.
- Кроме того, для тканей, которые не режут хорошо с vibratome, как кишечник, может сократить как можно тоньше полосы с скальпеля или лезвия бритвы. Положите только один раздел на лунку для скальпеля разделы разреза.
- Приступить к окрашиванию сразу же после резки готовых тканей. Держите разделы охлажденным до сведения к минимуму деградации во все времена, пока исправлена. Не позволяйте разделы высохнуть. Держите секций в охлажденном стерильной PBS-H.
- Инкубируйте срезов ткани в течение ночи с 0,5 мг / мл FITC сопряженных тетрамеров. Может включать мыши или не кролика антитела, направленные на внеклеточные эпитопов в этой инкубации, например, анти-CD8 антител, разбавленной 1:200 в блокировании решения. Используйте 1 мл раствора на лунку для этого и всех последующих инкубации, а также выполнять эту и все последующие инкубации при 4 ° С с тарелки на качалке платформы. Держите ткани камер, содержащих различные экспериментальные образцы разделены по крайней мере одна пустая хорошо, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение решения в последующих шагов.
- После первичной инкубации, мыть участки с охлажденным PBS-H в два раза (2X) в течение 20 минут каждый. Сделайте это путем передачи ткани камер для различных 24-и культуре ткани пластины, содержащей охлажденным PBS-H. Будьте осторожны, чтобы не капать содержимое из одного экспериментального образца в другую, при перемещении тканей камер. Для всех последующих инкубации и моет аналогичным передачи ткани камер чистую тарелку, содержащий соответствующие решения. Монитор секций в ткани камеры во время процедуры, чтобы убедиться, что разделы не застревают на сторонах ткани камер.
- Fix разделы со свежим PBS буфером 4% параформальдегида в течение 2 часов при комнатной температуре. Промыть холодной PBS-H 2X 5 минут каждый.
- Инкубируйте с кроликом анти-FITC антител, например Biodesign1: 10000, в блокировании решения от одного до трех дней. Для со-маркировки, могут включать в себя не-кролика антитела, направленные на внутриклеточные эпитопов в этой инкубации, а также. Для этого параметра выставить эпитопов при необходимости и пронизывают и блокировать клетки до начала второй инкубации.
- При использовании антител, направленных на внутриклеточные эпитопов антигенов, которые требуют извлечения из формальдегида фиксации, подвергать эпитопы путем кипячения 3 раза в 0,01 М мочевины, 10 секунд каждый раз, в микроволновой печи. Подождите 2 минуты между каждой отопления. Будьте очень осторожны, как кипящий раствор может заставить разделы из скважин. Если это произойдет, используйте кистьвыдвинуть секции из сторон ткани камере или с крышкой пластины обратно в нижней части соответствующей камеры ткани. Если антитела не требуют поиска антигена пропустить этот шаг.
- При использовании антител, направленных на внутриклеточные эпитопов, до второй инкубации, permeabolize и блокировать клетки в срезах тканей с PBS-H, содержащие 0,3% тритона Х-100, а 2% нормальной козьей сывороткой в течение одного часа. Затем выполните оставшиеся антитела инкубации в PBS-H, содержащие 0,3% тритона Х-100 и 2% нормальной козьей сывороткой.
- После второй инкубации, мыть секций в PBS-H в течение 20 минут до нескольких часов. Повторите два раза в общей сложности три стирок. Выполните окончательное инкубации с соответствующими флуоресцентно меченых антител. К примеру, козий анти-кролик-Cy3 и антимышиного-Alexa 488 разбавленный 1:1000 каждый в блокировании решения. Инкубируйте в течение одного-трех дней. Держите разделы защищенном от света месте, обернув пластин в фольгу в течение этого инкубационного и в дальнейшем, как свет флуорофоров утоляет.
- Вымойте секций в PBS-H в течение 20 минут до нескольких часов. Повторите два раза в общей сложности три стирок.
- Для IST в сочетании с ISH после исправления разделов после исправления в 4% параформальдегида в течение 1 часа для обеспечения тетрамеров и антител в месте, затем смойте секций с PBS-H снова и монтировать.
- Используйте кисть для передачи разделы предметное стекло. Пальто каждой секции с глицерином / желатин содержащие 4mg/ml н-пропил галлат или другие монтажные среды, содержащие консервант флуорофора и накройте покровным стеклом. Магазин слайдов в защищенном от света слайд таре при -20 °. Промыть пластины культуре ткани и удалить этикетки на крышки с алкоголем. Может повторного использования пластин.
- Анализ окрашенных срезах ткани с конфокальной микроскопии. Затем можно перейти к ISH.
2. Обнаружение зараженных вирусом-РНК + клеток на месте гибридизации.
Это на месте протокол гибридизации был изменен из наших ранее опубликованных протоколов 4,5 следующим образом:
- Re-среза 5-8-микронной толщины-sectionss из толстого на месте срезах, окрашенных тетрамер.
- 200-микронной толщины сечения нагревают при 70 ° C в течение 5 минут, чтобы отделить участок от слайда.
- Секция не встроенных в октябре на сухом льду.
- 8-микронной разделы резать криостат из толстых секций и придерживались silanized слайдов.
- Слайды можно хранить при температуре -80 ° C в запечатанной коробке для последующей гибридизации на месте.
- В гибридизация
- Увлажняет срезах тканей путем погружения слайда в течение 3 минут в каждом из 90% этанола и DEPC обработанной воды.
- Permeabilize срезах тканей путем нагревания в 10 мМ буфера цитрата (рН 6,0) при 98 ° С на водяной бане в течение 15 мин.
- Прохладный срезах тканей при комнатной температуре в течение 20-30 мин.
- Мыть два раза в DEPC обработанной воды в течение 3 мин.
- Acetylate срез ткани, погрузив слайдов в 0,25% уксусной кислоты в 0,1 М TEA (триэтаноламин, pH8.0) в течение 10 мин.
- Передача слайды в 0,1 М TEA (pH8.0) в течение 5 мин.
- Скрещиваться разделов до 35 С-меченых вирус-специфических (таких, как ВИЧ-1, SIV) зонда антисмысловых или чувство (отрицательный контроль на ВИЧ-1, SIV), или 35 S меченных LCMV riboprobes (складочном смысл и антисмысловых).
- Вымойте разделы дважды 2xSSC в течение 5 минут после гибридизации ночь на 42 ° C.
- Вымойте разделы STE (0,5 М NaCl, 1 мМ EDTA, 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5) в течение 5 мин.
- Дайджест секций с РНКазы и T1 в СТЭ при 37 ° С в течение 30 минут
- Вымойте секций в 2х SSC плюс 50% формамида в течение 5 мин.
- Вымойте разделы 1x SSC 10 мин.
- Вымойте секций в 0,5 х SSC 15 мин.
- Дегидрировать секций в 70, 80 и 100% этанола, содержащего 0,3 М ацетата аммония, каждые 5 мин.
- Пальто секций с ядерной эмульсии трек
- Сушить в темном помещении в течение 1 часа.
- Expose разделы при 4 ° С в течение 11 дней (ВИО) и 3 дня (LCMV).
- Разработка разделов в D19 (Kodak, Cat # 146 4593) в течение 3 мин, умойся в dH2O 30 секунд, исправить в Рапид-Fixer (Kodak, Cat # 146 4106) в течение 4 минут, умойся в dH2O 5 мин х 3 раза.
- Дегидрировать в 70%, 80% и абсолютного этилового спирта, 5 мин каждый.
- Горы слайды в люминесцентных совместимая среда Permount.
3. Приобретать конфокальной микроскопии изображений.
- Захват изображения с ISTH Bio-Rad MRC 1000 конфокальной микроскопии, или любой другой конфокальной микроскопии с Epi2-Blue Отражение устройства.
- Используйте Epi1-605 для красного тетрамера флуорохромом, Epi2-522 DF32 для зеленых CD8 флуорохромом и Epi2-Blue Отражение для зерен серебра (ISH сигнала в развитых автографов) на 20х (для SIV) или 60x (для LCMV)
- Последовательно собирать Z-серийный изображений на 1-микронной интервалом в три канала для каждого поля.
- Получение изображений со каждом разделе слевасправа, и сверху вниз, и имя каждого изображения в соответствии с ее строк и столбцов в файл Excel.
- Захват каждого изображения с ~ 20% перекрытием с соседними изображения, чтобы избежать пробелов в реконструированных монтаж изображения.
4. Изображение анализы: монтаж реконструкции изображения, мобильный центр тяжести расчетов и пространственного анализа.
- Проект Z-серийный изображений в одно изображение для каждого канала с конфокальной Assistant (версии 4.02.).
- Автоматически объединять проецируемого изображения из трех каналов в одно изображение RGB, используя Photoshop 7.0 Действие процедуры.
- Создание монтаж изображения прошиты объединены изображения вместе слоями в Photoshop 7.0.
- Ассоциированный отдельных зерен серебра и тетрамер пятно с клетками, и назначить X, Y координаты центров (центров тяжести) из SIV РНК + и тетрамер + клеток, используя Метаморф (версия 7.1.3.) Или Photoshop (можно получить у автора)
- Экспорт данных в центроида Excel файлов, цифровые номера для каждой ячейки. E: T отношения определяются из файлов Excel от общего числа тетрамер + и вирусной РНК + клеток в разделе.
Пространственные отношения между красным тетрамер + и синего SIV РНК + клетки собрать путем копирования и вставки их участков из Excel файлов в документ Photoshop. После уменьшения непрозрачности слоя для выравнивания и масштаба сетки так, что они совпадают, цвет-отбора и копирования и вставки в новый слой позиции синий РНК + клеток, а затем отбрасывая слой используется для выравнивания сетки, позиции из + тетрамера и вирусной РНК + клеток будут выявлены в сведенное изображение.
5. Дополнительные примечания
Если сокращение инфекционных ткани:
Работа в BSL2.5 лаборатории. Принимать особые меры предосторожности с бритвенными лезвиями. Положите бритву в лезвие vibratome крепление с щипцами. Если вы не можете положить лезвие в с щипцами, затем поместите его в перед добавлением ткани в баню, и не заменяют лезвия. После завершения резки, удаления лезвие с щипцами. Спрей лезвие с 70% этанола или DMQ перед удалением. Как всегда, распоряжаться лопастей в контейнере острых предметов. Изменение внешнего перчатки или промыть в дезинфицирующий после каждого контакта с тканью или загрязненных PBS в бак. Когда закончите, как при работе с инфекционным материалом, добавьте DMQ дезинфицирующие средства для PBS в баке и пусть сидят несколько минут до удаления. Утилизировать обеззаражены PBS в канализацию. Затем промыть резервуар с водой, чтобы удалить соль и дезинфицирующее средство. Чистая рабочее место и посуду с DMQ. Промыть посуду с водой.
Сделать из тетрамеров биотинилированного MHC мономеров:
Получить биотинилированного MHC класса I молекул, таких как HLA-A * 0201 / B 2 м / пептидные молекулы, производимые с любой Gag (SLYNTVATL), Пол (ILKEPVHGV), или не имеют отношения МАРТ пептид (ELAGIGILTV) пептидов из Beckman Coulter. Биотинилированные HLA-A * 0301 / B 2 м / пептидные молекулы, производимые с любой Gag (KIRLRPGGK) или NEF (QVPLRPMTYK) на NIAID объекта тетрамер. Тетрамеров создаются путем добавления 6 аликвоты FITC помечены ExtraAvidin (Sigma) в биотинилированного Маму * 01 / B 2 м / пептид мономеров в течение 8 часов до окончательного молярном соотношении 4,5:1. Обоснованием добавив Extravidin медленно, что во время ранних моментов времени есть переизбыток мономера, который уверяет, что все Extravidin добавил получает все четыре биотин сайтов границы. Позже в реакции, этот процесс является менее эффективным, поскольку там меньше мономера левой и больше шансов, что ExtrAvidin не будет иметь всех 4 участках границы. Если добавить все ExtrAvidin сразу реакция была бы менее эффективным и более Extravidin молекул бы только 2 или 3 мономеров прилагается.
Discussion
Так как вирус РНК используется в качестве маркера для инфицированных вирусом клеток в настоящем докладе, все реагенты до гибридизации должно быть РНКазой бесплатно. На месте процедуру гибридизации описаны здесь был изменен, чтобы сохранить флуоресцентный сигнал на месте окрашиванием тетрамера. С радиоавтографического сигнал от зараженных вирусами-клетки обнаружены на месте гибридизация на глубине около одной ячейке диаметра, толстым слоем используются для окрашивания на месте тетрамер должны перекроить в 5-8-микронной толщины секций.
Этот новый метод объединения на месте тетрамеров и гибридизация (ISTH) описаны здесь позволяет одновременно визуализации, отображения и анализа пространственных отношений вирус-специфических CD8 + T-клеток и инфицированные вирусом клетки-мишени. Этот метод может быть применен для оценки CD8 + Т-клеток, основанных вакцины и в других, не вирус возбудителя и принимающих взаимодействий. Метод анализа изображений, описанные здесь также может быть адаптировано для изучения пространственных отношений любых двух клеточных популяций взаимодействующих на месте, например, мы недавно использовали центроида процедуры отображения в изучении ВИЧ-1 половым путем в приматах модели обезьяньего иммунодефицита вирусная инфекция макак-резус 6
Acknowledgments
Мы благодарим J. Седжвик за помощь в создании конфокальной микроскопии для захвата изображения зерен серебра; при частичной поддержке грантов NIH AI48484 (ATH), AI20048 (РА), а AI066314 (CJM); Национальный центр по изучению ресурсов гранта. RR00169 (CNPRC, Университет Калифорнии, Дэвис).
Materials
Solutions and Reagents: |
|||
|
|||
Special equipment |
|||
|
|||
IST Reagents Quick Reference |
|||
PBS-H (phosphate buffered saline with heparin) |
|||
|
|||
1x PBS + 10X heparin |
|||
|
|||
PBS-H/ 2% NGS (normal goat serum) |
|||
|
|||
PBS-H/ 2% NGS/ 0.3% Triton X-100 |
|||
|
|||
PBS-H/ 0.3% Triton X-100 |
|||
|
|||
4% LMP Agarose |
|||
|
|||
GG-NPG (glycerol gelatin with n-propyl galate |
|||
|
|||
4% paraformaldehyde |
|||
|
|||
Urea 0.01 M |
|||
|
References
- Altman, J. D., Moss, P. A. H., Goulder, P. J. R., Barouch, D. H., McHeyzer-Williams, M. G. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
- Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting Edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. Journal of Immunology. 165, 617-61 (2000).
- Qingsheng, L. i, Skinner, P. J., Ha, S. -J., Duan, L., Mattila, T., Hage, A., White, C., Barber, D. L., O'mara, L., Southern, P. J. Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcome in early viral infection. Science. 323, 1726-1729 (2008).
- Haase, T., Haase, K., Zupancic, M., Sedgewick, G., Faust, R. A., Melroe, H., Cavert, W., Gebhard, K., Staskus, K., Zhang, Z. Q. Perelson Quantitative Image Analysis of HIV-1 Infection in Lymphoid Tissue. Science. 274, 985-989 (1996).
- Li, Q., Duan, L., Estes, J. D., Ma, Z. M., Rourke, T., Wang, Y., Reilly, C., Carlis, J., Miller, C. J., Haase, A. T. Peak SIV replication in resting memory CD4 T cells depletes gut lamina propria CD4 T cells. Nature. 434, 1148-1152 (2005).
- Li, Q. ingsheng, Estes, J. acobD., Schlievert, P. atrickM., Duan, L. ijie, Brosnahan, A. mandaJ., Southern, P. eterJ., Reilly, C. avanS., Peterson, M. arnieL., Schultz-Darken, N. ancy, Brunner, K. evinG., Nephew, K. arlaR., Pambuccian, S. tefan, Lifson, J. effreyD., &, J. ohnV. C. arlis, Haase, A. shleyT. Glycerol monolaurate prevents mucosal SIV transmission. Nature. , (2009).