Summary
Um novo meio de medir a neurotransmissão opticamente usando análogos de dopamina fluorescente.
Abstract
O sistema nervoso transmite sinais entre neurônios através de liberação de neurotransmissores durante a fusão das vesículas sinápticas. Para observar a absorção e liberação de neurotransmissores a partir de terminais pré-sinápticos individuais diretamente, nós projetamos fluorescentes neurotransmissores falsa como substratos para o transportador das vesículas sinápticas monoamina. Usando estas sondas para liberar imagem de dopamina no estriado, fizemos várias observações pertinentes a plasticidade sináptica. Descobrimos que a fração de vesículas sinápticas liberando o neurotransmissor por estímulo foi dependente da freqüência de estímulo. A cineticamente distintas "reserva" da população das vesículas sinápticas não foi observada nessas condições experimentais. A heterogeneidade dependente da freqüência de terminais pré-sinápticos foi revelado que era dependente, em parte, os receptores de dopamina D2, indicando um mecanismo para dependente da freqüência de codificação da seleção pré-sináptica.
Hui Zhang e Niko Gubernator G. contribuíram igualmente para este trabalho.
Protocol
Este método foi utilizado na pesquisa, publicada na Gubernator et al. Ciência 324 (5933). 1441-1444 (2009) .
1. Preparando aguda fatias estriatais
- Antes de preparar fatias estriatal aguda, deve-se oxigenar o líquido cefalorraquidiano artificial (ASCF) e chill-lo com gelo por pelo menos 15 minutos antes da extração de cérebro. Manter o frio do gelo ACSF e oxigenado durante a dissecção. ACSF (em mM): NaCl 125, KCl 2.5, NaHCO 3 26, CaCl 2 2,4, MgSO4 1,3, KH 2 PO 4 0,3, glicose 10, HEPES 5; pH 7,3-7,4, 290-295 mOsm.
- Decapitar rato macho sem anestesia.
- Extrair todo o cérebro do rato, e montá-la na bandeja vibratome colocados no vibratome usando Krazy Glue ®. Extração de cérebro e de montagem deve ser feita dentro de 2 minutos. Durante este tempo, certifique-se para manter o frio do gelo ACSF e oxigenado para manter os tecidos saudáveis.
- Corte coronal fatias do cérebro estriado na espessura 250μm bregma entre 1,54-0,62 1. Três fatias inteiras serão obtidos que podem então ser cortada em 6 fatias meia com uma agulha.
- Incubar as fatias de cérebro em ACSF oxigenada em temperatura ambiente por pelo menos 1 hora antes de carregá-sonda. Fatias de mostrar o carregamento FFN511 bom e permanecer ativo para geração de imagens de até 4 horas após a preparação fatia.
2. Carregando FFN511
- Prepare FFN511 solução de carga (10μM FFN511 em ACSF); também preparar 100μM ADVASEP-7 em ACSF. Todas as soluções devem ser preparadas de fresco e oxigenado pelo menos 15 minutos antes do embarque para as fatias.
- Individualmente incubar fatia com FFN511 solução de carga por 30 minutos em temperatura ambiente.
- Em seguida, retire o corante ligado ao tecido extracelular incubando a fatia carregada em oxigenado 100μM ADVASEP-7 ACSF por 30 minutos em temperatura ambiente 2. Fatias estão agora prontos para a imagem latente.
3. Imagem FFN511 no fatias de cérebro
Imagem de FFN511 nos cortes é realizada utilizando multifotônica microscópio de varredura a laser. Estamos usando um Prairie Ultima multifotônica microscópio de varredura por laser (Estávamos usando uma Zeiss LSM 510 NLO multifotônica microscópio de varredura a laser antes e alguns resultados foram obtidos com o microscópio Zeiss).
- Coloque a fatia FFN511-carregado na câmara de gravação (RC-27L, Warner) e superfuse com ACSF oxigenado a um fluxo de 1-2 ml por minuto. Em seguida, coloque uma harpa de platina com cordas de nylon em cima da fatia para minimizar o movimento durante o experimento. Para minimizar ainda mais o movimento, permitir que a fatia para estabilizar por pelo menos 10 minutos na câmara antes da imagem.
- Visualizar e localizar o striatum dorsal, com luminescência campo brilhante sob a objetiva de 10x imersão em água.
- Lugar e posição do bipolar torcida eléctrodos de tungsténio na região se realizar um experimento de estimulação. A área de imagem ideal está localizado dentro de 300 mm entre as duas pontas do eléctrodo bipolar estimulante. Coloque esta região no centro do campo visual.
- Imagem FFN511 marcado terminais estriatal em um (0,9 NA) O objectivo da água por ultravioleta 63x de imersão. FFN511 está animado com 760 nm com um laser de Mai Tai Física Spectral e fluorescência ideal de terminais estriatal é visto através de um filtro passa-banda (480-520 nm). As imagens são capturadas no formato de 12-bit com 75 x 75 mM regiões de interesse em 512 pixels de resolução x 512. Estimulado para experimentos de descoloração, para compensar a mudança do eixo z, z uma série de imagens 07/05, separados por 1 mícron no plano z, é obtido para cada período de tempo.
4. FFN511 Descoloração
A etiqueta pode ser descorados FFN511 quer por alta concentração de KCl (70 mM usamos KCl), (+)-anfetamina sulfato (AMPH, 20 mM), ou estimulação elétrica. No experimento de descoloração KCl, quando uma solução ACSF alta de potássio é aplicado à fatia do cérebro, o FFN511 destains label dentro de 2 minutos. Registro xyz-t imagens para acompanhar FFN511 descoloração ao longo do tempo. A seguir descreve estimulação elétrica dependente de descoloração terminal dopamina:
- Para acompanhar FFN511 descoloração ao longo do tempo, xyz-t as imagens são gravadas. Para garantir movimento mínimo da fatia (menos do que 4 mm no eixo z) e não fotobranqueamento pelo laser, controle de imagens de séries temporais do z-stack deve ser obtido por pelo menos 5 minutos antes da estimulação. Caso contrário, ajustar a potência do laser.
- Após essas imagens de controle, continuam a imagem xyz-t, enquanto começam a estimulação nas freqüências de 1, 4 ou 20 Hz. Estímulos em 1, 4 ou 20 Hz (300 mS x 1 mA) são aplicados para o estriado localmente por um isolador de estímulo Iso-Flex acionada por um gerador de Mestre-8 de pulso (Ampi, Jerusalém, Israel) através de eletrodos bipolares. Para minimizara variação da despolarização dos locais de lançamento, temos usado um protocolo de estimulação aplicando 150% da intensidade de estimulação máxima determinada por voltametria cíclica.
- Usar o software adequado para análise de imagem. Em nosso laboratório, usamos Image J (Wayne Rosband, National Institutes of Health, Rockville, MD) e custom-written software em IDL (Research Systems, Boulder, CO) para quantificar a fluorescência puncta e as mudanças com Time3.
Resultados Represenative
A Figura 1 mostra o carregamento na FFN511 fatia estriatal está concluída. Imagens representativas utilizando objetiva de 10x e 60x são mostrados na Fig.1. A rotulagem seletiva de terminais de dopamina pode ser descorados por 20 mM de anfetamina.
A Figura 2 mostra de descoloração de rotulagem FFN511 por KCl elevado.
A Figura 3 mostra descoloração de rotulagem FFN511 por estimulação elétrica local.
Figura 1 FFN511 rótulos terminais de dopamina no estriato-cortical viver fatias aguda (A) de rotulagem, pela FFN511 em aguda córtico-estriatal fatia ao vivo:.. Rotulagem abundante no corpo estriado (STR), rotulagem esparsa no córtex (CTX), e sem rótulo no corpo caloso (CC). Barra de escala:. 100 mm (B) Descoloração de FFN511 do striatum por anfetamina. Painéis da esquerda: antes de anfetaminas; painéis direita: após 20 minutos de 20 de anfetamina mM. Barra de escala: 10 mM.
Figura 2. Descoloração de FFN511 rotulagem por KCl elevado. Rotulagem FFN511 é descorados dentro de 2 min de aplicação de 70 mM KCl em ACSF. Barra de escala: 10μm.
Figura 3. Dependente da freqüência de descoloração de rotulagem em FFN511 striatum. (A) estimulação local em 4 Hz resultou na descoloração dos terminais. Estimulação começou em t = 0. Barra de escala: 5 mm (B) Descoloração de FFN511 a 4 Hz é Ca 2 + - e dependente da freqüência.. Controles não receberam estimulação (153 puncta de 3 fatias). Descoloração com cloreto de cádmio (200 mM) foi idêntico aos controles não estimuladas (475 puncta de 5 fatias). As curvas de descoloração para cada freqüência de estimulação foram ajustados por uma função de decaimento exponencial simples e meia-vida (t 1 / 2) valores calculados como τ x 0,693 (1 Hz: 765 puncta de 9 fatias, 4 Hz: 410 puncta de 7 fatias, 20 Hz: 416 puncta de 6 fatias). Consulte a micrografia de vídeo de dois fótons de microscopia de FFN511 descoloração durante exocitose numa preparação estriado cerebral fatia.
Discussion
Neste vídeo, demonstramos um método de visualizar usando análogos opticamente neurotransmissão da dopamina fluorescente. FFN511 é a primeira geração de FFNs temos desenvolvido. Embora tenha sido projetado visando o transportador vesicular neuronal monoamina (VMAT2), que transporta neurotransmissores monoamina do citoplasma em vesículas sinápticas e, especificamente, etiquetas terminais de dopamina no estriado e catecolaminas presumido e / ou terminais de serotonina no córtex (como mostrado na Ciência papel), um período de carga adequado é fundamental para a especificidade desde FFN511 é relativamente hidrofóbica. Descobrimos que a incubação por mais de 40 minutos irá resultar em coloração inespecífica extensa em fatias estriatais. A especificidade pode ser diretamente determinada pela descoloração usando uma alta concentração de KCl, o que deve provocar a libertação de FFN funcional dentro de vesículas sinápticas. Exposição da fatia para FFN511 para menos de 15 minutos irá resultar em sinal fluorescente fraco devido à carga insuficiente do corante nos terminais. Neste protocolo, usamos 100μM ADVASEP-7 para remover o corante ligado ao tecido extracelular. Este passo não é necessário, mas se ele for omitido, o tempo de washout em ACSF precisa ser prolongada. Em resumo, dependendo da preparação que você escolheu, você precisará modificar o período de concentração e de carga para determinar rotulagem ideal.
Acknowledgments
D. Sames graças A Harold G. & Leila Y. Mathers Fundação de Caridade e Iniciativas da Universidade de Columbia em Ciência e Engenharia.
D. Sames e D. Sulzer agradecer à Fundação McKnight para as inovações tecnológicas em McKnight Prêmio Neuroscience
D. Sulzer graças NIDA, NIMH, e os Picower e Fundações da doença de Parkinson.
Graças H. Zhang NARSAD.
RH Edwards graças a Michael J. Fox Foundation, a National Parkinson Foundation, NIDA e NIMH.
Agradecemos a Robert Burke por 6-OHDA injeções e conselho, Mark Sonders para discussão útil, Merek Siu para imagens de análise, programação e Schmoranzer Jan de apoio técnico com a configuração de microscopia TIRF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one) | Columbia University - Dalibor Sames Lab | ||
| ADVASEP-7 | CyDex | AR-OA7-005 | |
| RC-27L Recording chamber | Warner Instruments | 64-0375 | |
| PELCO PrepEze 6-Well Holder | Ted Pella, Inc. | 36157-1 | For slice incubation |
| Master-8 pulse stimulator and Iso- Flex stimulus isolator | AMPI |
References
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxi coordinators. , Academic Press. San Diego. (1997).
- Kay, A. R. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 8098-8117 (1999).
- Bamford, N. S. Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals. Neuron. 42, 653-653 (2004).
