Summary
وسائل جديدة لقياس العصبي الدوبامين بصريا باستخدام النظير الفلورسنت.
Abstract
الجهاز العصبي بإرسال إشارات بين الخلايا العصبية عن طريق الافراج عن العصبي خلال انصهار حويصلة متشابك. لمراقبة امتصاص الناقل العصبي ، والإفراج عن محطات قبل المشبكي فردية مباشرة ، قمنا بتصميم العصبية كاذبة الفلورسنت بمثابة ركائز للنقل حويصلة متشابك مونوامين. باستخدام هذه التحقيقات إلى الإفراج عن الدوبامين الصورة في المخطط ، قدمنا العديد من الملاحظات ذات الصلة اللدونة متشابك. وجدنا أن نسبة ضئيلة من الحويصلات متشابك الافراج العصبي في التحفيز كانت تعتمد على وتيرة التحفيز. ولم يلاحظ وجود متميزة kinetically "احتياطي" السكان حويصلة متشابك في ظل هذه الظروف التجريبية. وقد كشفت عدم التجانس التي تعتمد على تردد المحطات قبل المشبكي التي كانت تعتمد في جزء منها على مستقبلات الدوبامين D2 ، مشيرا الى آلية لتواتر التي تعتمد على اختيار الترميز قبل المشبكي.
ساهم هوي تشانغ ونيكو Gubernator G. بالتساوي على هذا العمل.
Protocol
وقد استخدم هذا الأسلوب في البحث عنها في Gubernator وآخرون ، علم 324 (5933). 1441-1444 (2009) .
1. إعداد شرائح مخططي الحاد
- قبل إعداد شرائح مخططي الحاد ، لا بد من الأوكسجين السائل النخاعي الاصطناعي (ASCF) والبرد مع الثلج لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل استخراج المخ. الحفاظ على الجليد الباردة ACSF والاوكسيجين خلال التشريح. ACSF (مم) : كلوريد الصوديوم 125 ، بوكل 2.5 ، NaHCO 3 26 ، 2 CaCl 2.4 ، 1.3 MgSO4 ، KH 2 PO 4 0.3 ، الجلوكوز 10 ، HEPES 5 ؛ 7،3-7،4 درجة الحموضة ، mOsm 290-295.
- قطع رأس الفأر الذكور دون تخدير.
- استخراج الدماغ كله من الماوس ، وتركيبها على درج vibratome المفروضة على استخدام vibratome Krazy ® الغراء. ويجب أن يتم استخراج خلايا المخ والمتصاعدة داخل 2 دقيقة. خلال هذا الوقت ، تأكد للحفاظ على البرودة والجليد ACSF الاوكسيجين للحفاظ على الأنسجة السليمة.
- قطع الاكليلية شرائح سمك في الدماغ مخططي 250μm bregma بين 1،54-0،62 1. وسيتم الحصول على ثلاث شرائح بأكملها ومن ثم يمكن مقطعة إلى شرائح half 6 مع إبرة.
- احتضان شرائح الدماغ في ACSF الاوكسيجين في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 1 ساعة قبل تحميل التحقيق. عرض شرائح جيدة FFN511 التحميل وتظل نشطة لتصوير تصل إلى 4 ساعات بعد إعداد شريحة.
2. تحميل FFN511
- إعداد FFN511 حل التحميل (10μM FFN511 في ACSF) ، وتعد أيضا 100μM ADVASEP - 7 في ACSF. وينبغي إعداد جميع الحلول الطازجة والاوكسيجين على الأقل 15 دقيقة قبل التحميل الى شرائح.
- احتضان شريحة على حدة مع حل FFN511 التحميل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- ثم إزالة الصبغة منضمة إلى الأنسجة خارج الخلية التي يحتضنها شريحة تحميلها في الاوكسيجين ACSF ADVASEP - 7 100μM لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة 2. شرائح هي الآن جاهزة للتصوير.
3. التصوير FFN511 في شرائح الدماغ
يتم إجراء تصوير FFN511 في شرائح باستخدام مجهر الليزر multiphoton المسح. نحن نستخدم الليزر أولتيما المرج المسح multiphoton المجهر (كنا باستخدام LSM زايس 510 NLO مجهر المسح الضوئي ليزر multiphoton سبق وتم الحصول على بعض النتائج مع المجهر زايس).
- ضع شريحة FFN511 محملة في غرفة التسجيل (RC - 27L ، وارنر) ، وsuperfuse ACSF مع الاوكسيجين في معدل تدفق 1-2 مل في الدقيقة الواحدة. ثم ضع القيثارة البلاتين مع سلاسل من النايلون على أعلى شريحة لتقليل الحركة أثناء التجربة. لمزيد من تقليل الحركة ، والسماح للشريحة لتحقيق الاستقرار في ما لا يقل عن 10 دقيقة في غرفة قبل التصوير.
- تصور وتحديد المخطط الظهري مع التلألؤ مجال مشرق في ظل الهدف الماء الغمر 10X.
- مكان وموقف أقطاب القطبين التنغستن الملتوية في هذه المنطقة اذا إجراء تجربة التحفيز. وتقع منطقة التصوير المثالي على مسافة 300 ميكرون في بين اثنين من نصائح القطب القطبين محفزة. وضع هذه المنطقة في وسط الميدان البصري.
- صورة FFN511 المسمى مخططي المحطات تحت الماء الهدف 63x (0.9 NA) فوق البنفسجية الغمر. هو متحمس FFN511 نانومتر في 760 مع ليزر ماي تاي من الفيزياء ومضان الطيفي الأمثل لمحطات مخططي وينظر من خلال شريط تمرير ترشيح (480-520 نانومتر). يتم التقاط الصور في 12 بت تنسيق مع 75 ميكرون 75 × المناطق ذات الاهتمام في القرار 512 × 512 بكسل. لحفز التجارب destaining ، ويتم الحصول على تعويض عن ض محور التحول ، A - Z سلسلة من الصور 5-7 ، مفصولة 1 ميكرومتر في Z - الطائرة ، لكل فترة زمنية.
4. FFN511 Destaining
ويمكن تسمية destained FFN511 إما عن طريق تركيز عال من بوكل (70 نستخدم بوكل مم) ، (+) - المنشطات كبريتات (AMPH ، 20 ميكرون) ، أو التحفيز الكهربائي. في التجربة destaining بوكل ، عندما يتم تطبيق ACSF البوتاسيوم عالية حل لشريحة الدماغ ، وتسمية destains FFN511 داخل 2 دقيقة. سجل XYZ - T الصور إلى المسار FFN511 destaining مع مرور الوقت. فيما يلي وصف لالتحفيز الكهربائية التي تعتمد على محطة destaining الدوبامين :
- لتعقب FFN511 destaining بمرور الوقت ، يتم تسجيل XYZ - T الصور. وينبغي الحصول على ضمان الحد الأدنى من الحركة من شريحة (أقل من 4 ميكرون في محور ض) وليس photobleaching بواسطة الليزر والصور تحكم سلسلة زمنية من ض المكدس للحصول على ما لا يقل عن 5 دقائق قبل التحفيز. خلاف ذلك ، وضبط قوة الليزر.
- هذه الصور التالية السيطرة ، ومواصلة التصوير XYZ - T في حين بدء التحفيز على ترددات من 1 أو 4 أو 20 هرتز. يتم تطبيق حوافز هرتز في 1 و 4 أو 20 (300 ميكرو ثانية × 1 مللي أمبير) إلى المخطط محليا عن طريق التحفيز المعزل ISO - فليكس سببها الرئيسي - 8 مولد النبض (AMPI ، القدس ، إسرائيل) باستخدام أقطاب القطبين. للحد منالاختلاف في الاستقطاب من مواقع الإطلاق ، لقد اعتدنا على بروتوكول تحفيز تطبيق 150 ٪ من شدة الإثارة القصوى التي يحددها voltammetry دوري.
- استخدام البرمجيات المناسبة لتحليل التصوير. في المختبر ، ونحن نستخدم صورة J (وين Rosband والمعاهد الوطنية للصحة ، روكفيل ، دكتوراه في الطب) ، وبرامج مخصصة مكتوب في IDL (بحوث النظم ، بولدر ، كولورادو) لقياس نقاط ومضان والتغييرات مع time3.
Represenative النتائج
الشكل 1 يبين FFN511 التحميل في شريحة مخططي اكتمال الآن. وتظهر الصور باستخدام ممثل الهدف 60x 10x وفي Fig.1. ويمكن وسم destained الانتقائي لمحطات الدوبامين التي المنشطات ميكرومتر 20.
ويبين الشكل 2 destaining FFN511 من العلامات التي بوكل عالية.
ويبين الشكل 3 destaining FFN511 من العلامات التي التحفيز الكهربائي المحلي.
الشكل 1 FFN511 تسميات محطات الدوبامين في الجسم المخطط شرائح القشرية ، يعيش الحاد (A) التي وصفها FFN511 الحادة في شريحة القشرية المخططية - العيش :. التوسيم وفرة في المخطط (STR) ، ووضع العلامات تشتت في القشرة (CTX) ، وليس في تسمية الجسم الثفني (CC). شريط الحجم : 100 ميكرون (B) من Destaining FFN511 من المخطط بواسطة المنشطات. لوحات اليسار : قبل المنشطات ؛ لوحات اليمين : بعد 20 دقيقة من المنشطات ميكرومتر 20. شريط الحجم : 10 ميكرون.
الشكل 2. Destaining FFN511 من العلامات التي بوكل عالية. هو destained FFN511 العلامات داخل التطبيق 2 دقيقة من بوكل 70 ملم في ACSF. شريط النطاق : 10μm.
الشكل 3. الترددات المعتمدة من destaining FFN511 الوسم في المخطط (أ) أدى التحفيز المحلية في 4 هرتز في destaining من المحطات. بدأت في تحفيز ر = 0. مقياس شريط : 5 ميكرون (B) من Destaining FFN511 في 4 هرتز هو كا 2 + -- والتي تعتمد على الترددات. تلقت لا تسيطر التحفيز (153 نقاط وشرائح من 3). Destaining مع كلوريد الكادميوم (200 ميكرومتر) كان مطابقا للضوابط unstimulated (475 نقاط وشرائح من 5). وكانت تناسب منحنيات destaining لكل تردد التحفيز عن طريق الاضمحلال الأسي وظيفة واحدة ونصف الحياة (ر 1 / 2) القيم المحسوبة على النحو τ X 0.693 (1 هرتز : 765 نقاط وشرائح من 9 ، 4 هرتز : 410 نقاط وشرائح من 7 ، 20 هرتز : 416 نقاط وشرائح من 6). يرجى الرجوع إلى الفيديو صورة مجهرية من 2 الفوتون المجهري من خلال FFN511 destaining إيماس في إعداد شريحة الدماغ الجسم المخطط.
Discussion
في هذا الفيديو ، ونحن يبرهن على وجود طريقة لتصور بصريا العصبي باستخدام الدوبامين النظير الفلورسنت. FFN511 هو الجيل الأول من FFNs قمنا بتطويرها. على الرغم من أنه تم تصميمه من خلال استهداف الخلايا العصبية نقل مونوامين الحويصلي (VMAT2) الذي يحمل مونوامين الناقلات العصبية من السيتوبلازم إلى الحويصلات متشابك ، وتسميات محطات تحديدا الدوبامين في المخطط ويفترض الكاتيكولامينات و / أو محطات السيروتونين في القشرة (كما هو موضح في العلوم الورق) ، فترة التحميل المناسبة أمر بالغ الأهمية لخصوصية منذ FFN511 هو مسعور نسبيا. وجدنا أن الحضانة لمدة أطول من 40 دقيقة وسوف يؤدي إلى تلطيخ اللانوعي شرائح واسعة في الجسم المخطط. ويمكن تحديدها بشكل مباشر على خصوصية destaining بواسطة استخدام تركيزات عالية من بوكل ، الذي ينبغي أن يتسبب في انطلاق FFN داخل الحويصلات متشابك وظيفية. وسوف تعرض على شريحة FFN511 لأقل من 15 دقيقة نتيجة في إشارة الفلورسنت ضعيفة نظرا لعدم كفاية تحميل الصبغة في المحطات. في هذا البروتوكول ، ونحن نستخدم 100μM ADVASEP - 7 لإزالة الصبغة منضمة إلى الأنسجة خارج الخلية. هذه الخطوة غير ضرورية ، ولكن إذا تم حذفها ، فشل في ذلك الوقت ACSF يحتاج إلى فترة طويلة. باختصار ، اعتمادا على إعداد اخترت ، وسوف تحتاج إلى تعديل فترة الاعتقال والتحميل لتحديد العلامات الأمثل.
Acknowledgments
دال Sames شكرا وهارولد G. & Y. ليلى ماذرز الخيرية والمبادرات في جامعة كولومبيا في العلوم والهندسة.
دال Sames وسولزر D. أشكر مؤسسة ماكنايت للابتكارات التكنولوجية في ماكنايت جائزة العلوم العصبية
دال سولزر الشكر النداء ، NIMH ، وPicower المؤسسات ومرض باركنسون.
H. بفضل تشانغ NARSAD.
RH ادواردز يشكر مايكل جيه فوكس ، ومؤسسة باركنسون المؤسسة الوطنية ، والمعهد الوطني NIMH.
نشكر روبرت بورك لمدة 6 - OHDA الحقن والمشورة ، Sonders مارك للمناقشة مفيدة ، Merek سيو للبرمجة التحليل والتصوير ، وSchmoranzer يناير للحصول على الدعم التقني مع الإعداد TIRF المجهري.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one) | Columbia University - Dalibor Sames Lab | ||
| ADVASEP-7 | CyDex | AR-OA7-005 | |
| RC-27L Recording chamber | Warner Instruments | 64-0375 | |
| PELCO PrepEze 6-Well Holder | Ted Pella, Inc. | 36157-1 | For slice incubation |
| Master-8 pulse stimulator and Iso- Flex stimulus isolator | AMPI |
References
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxi coordinators. , Academic Press. San Diego. (1997).
- Kay, A. R. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 8098-8117 (1999).
- Bamford, N. S. Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals. Neuron. 42, 653-653 (2004).
