Summary
חדש אמצעים למדוד עצבית אופטית באמצעות תחליפי דופמין ניאון.
Abstract
מערכת העצבים המשדרת אותות בין הנוירונים באמצעות שחרור הנוירוטרנסמיטר במהלך איחוי שלפוחית סינפטית. כדי לצפות ספיגת העצבי שחרור מסופי presynaptic הפרט ישירות, עיצבנו נוירוטרנסמיטורים שווא ניאון כמו מצעים עבור טרנספורטר שלפוחית סינפטית אוקסידאז. באמצעות בדיקות אלה לשחרר תמונה הדופמין בסטריאטום, עשינו מספר תצפיות רלוונטי הפלסטיות הסינפטית. מצאנו כי חלק קטן של שלפוחית סינפטית שחרור הנוירוטרנסמיטר לכל גירוי היה תלוי בתדירות הגירוי. נפרדים kinetically "מילואים" האוכלוסייה שלפוחית סינפטית לא נצפתה בתנאים ניסיוניים. ההטרוגניות תדירות תלויי של מסופי presynaptic נחשף כי היה תלוי בחלקו על קולטני דופאמין D2, המציין מנגנון תדירות תלויי קידוד הבחירה presynaptic.
הואי זאנג Gubernator ניקו G. תרמו באופן שווה על עבודה זו.
Protocol
בשיטה זו נעשה שימוש במחקר דיווחו Gubernator et al. Science 324 (5933). 1441-1444 (2009) .
1. הכנת פרוסות striatal חריפה
- לפני הכנת פרוסות striatal חריפה, יש נוזל חמצן מלאכותי השדרה (ASCF) ומקררים אותו עם קרח למשך 15 דקות לפחות לפני מיצוי את המוח. שמור על קור קרח ACSF ו מחומצן במהלך הניתוח. ACSF (מ"מ): 125 NaCl, KCl 2.5, NaHCO 3 26, CaCl 2 2.4, MgSO4 1.3, KH 2 PO 4 0.3, גלוקוז 10, HEPES 5; pH 7.3-7.4, 290-295 mOsm.
- לערוף עכבר זכר ללא הרדמה.
- חלץ את המוח כולו של העכבר, ו הר זה על מגש vibratome דגש על vibratome באמצעות בדבק מגע ® דבק. מיצוי המוח גובר חייב להיעשות תוך 2 דקות. במהלך הזמן הזה, הקפד לשמור על קור קרח ACSF ו מחומצן כדי לשמור על הרקמה הבריאה.
- גזור העטרה פרוסות המוח striatal על עובי 250μm גבחת בין 1.54-0.62 1. שלוש פרוסות כל יושג אשר לאחר מכן ניתן לחתוך פרוסות 6 וחצי עם מחט.
- דגירה את פרוסות המוח ACSF מחומצן בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות 1 לפני טעינת בדיקה. Slices להציג טעינת טוב FFN511 ולהישאר פעיל הדמיה עד 4 שעות לאחר ההכנה פרוסה.
2. טוען FFN511
- הכן FFN511 פתרון הטעינה (10μM FFN511 ב ACSF); גם להכין 100μM ADVASEP-7 ב ACSF. כל הפתרונות צריכים להיות מוכנים טרי מחומצן לפחות 15 דקות לפני טעינת לפרוסות.
- בנפרד דגירה פרוסה עם פתרון FFN511 טעינה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- ואז להסיר את צבען חייב רקמה תאית על ידי דוגרים הפרוסה טעון מחומצן 100μM ADVASEP-7 ACSF במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר 2. Slices מוכנים כעת עבור דימות.
3. הדמיה FFN511 את פרוסות המוח
הדמיה של FFN511 ב הפרוסות מבוצע באמצעות מיקרוסקופ multiphoton סריקת לייזר. אנחנו משתמשים Ultima Prairie multiphoton מיקרוסקופ סריקת לייזר (היינו באמצעות Zeiss LSM 510 NLO multiphoton מיקרוסקופ סריקת לייזר בעבר כמה תוצאות התקבלו עם מיקרוסקופ Zeiss).
- מניחים את נתח FFN511 טעון בתא הקלטה (RC-27L, וורנר) ו superfuse עם ACSF חמצן בקצב זרימה של 1-2 מ"ל לדקה. אז במקום נבל פלטינה עם מיתרי ניילון על גבי הפרוסה כדי למזער את התנועה במהלך הניסוי. כדי לצמצם עוד יותר תנועה, לאפשר הפרוסה לייצב במשך לפחות 10 דקות בחדר לפני הדמיה.
- המחש לאתר את הסטריאטום הגב עם הארה בשדה בהיר תחת מטרה מים 10x טבילה.
- המקום ואת המיקום המעוות אלקטרודות טונגסטן דו קוטבית באזור זה, אם ביצוע הניסוי גירוי. האזור הדמיה אידיאלי ממוקם בתוך 300 מיקרומטר בין שני קצות האלקטרודה מגרה דו קוטבית. מניחים את האזור במרכז שדה הראייה.
- תמונה FFN511 שכותרתו מסופי striatal תחת מטרה (0.9 NA) 63x טבילה במים אולטרה סגול. FFN511 הוא נרגש על 760 ננומטר עם המאי טאי לייזר לפיסיקה רפאים הקרינה האופטימלי של מסופי striatal נתפסת דרך לעבור הלהקה המסנן (480-520 ננומטר). תמונות נלכדים בתבנית של 12 סיביות עם 75 x 75 אזורים מיקרומטר עניין ברזולוציה של 512 x 512 פיקסלים. על הניסויים destaining מגורה, כדי לפצות על שינוי Z-ציר, סדרה של תמונות-Z 5-7, מופרדים 1 מיקרומטר במטוס-z, מתקבל עבור כל פרק זמן.
4. FFN511 Destaining
התווית FFN511 ניתן destained או על ידי ריכוז גבוה של KCl (אנו משתמשים KCl 70 mM), (+), אמפטמין סולפט (AMPH, 20 מיקרומטר), או גירוי חשמלי. במהלך הניסוי destaining KCl, כאשר פתרון גבוה ACSF אשלגן מוחל על פרוסת המוח, FFN511 destains תווית תוך 2 דקות. שיא xyz-t תמונות כדי לעקוב FFN511 destaining לאורך זמן. להלן תיאור גירוי חשמלי תלויי מסוף destaining דופמין:
- כדי לעקוב אחר FFN511 destaining לאורך זמן, xyz-t תמונות נרשמות. כדי להבטיח תנועה מינימלית של הפרוסה (פחות מ -4 מיקרומטר Z-ציר) ולא על ידי photobleaching, לייזר לשלוט בזמן סדרת תמונות של מחסנית-z צריכים לקבל לפחות 5 דקות לפני הגירוי. אחרת, להתאים את כוח לייזר.
- בעקבות התמונות האלה שליטה, להמשיך את ההדמיה xyz-t זמן להתחיל את הגירוי בתדרים של 1, 4 או 20 הרץ. גירויים בבית 1, 4 או 20 הרץ (300 μs x 1 mA) מוחלים בסטריאטום מקומית על ידי המבודד Iso-Flex גירוי מופעלות על ידי גנרטור Master-8 הדופק (AMPI, ירושלים) באמצעות אלקטרודות דו קוטבית. כדי למזערוריאציה שלילת קוטביות של אתרי שחרור, השתמשנו פרוטוקול גירוי החלים 150% של עוצמת הגירוי המקסימלי נקבע על ידי voltammetry מחזורית.
- השתמש בתוכנות ראוי לניתוח הדמיה. במעבדה שלנו, אנו משתמשים תמונה J (ויין Rosband, המכונים הלאומיים לבריאות, Rockville, MD) אישית בכתב תוכנה IDL (Research Systems, Boulder, CO) לכמת את הקרינה puncta והשינויים עם time3.
Represenative תוצאות
איור 1 מציג FFN511 טוען לתוך פרוסת striatal הושלמה. תמונות באמצעות נציג אובייקטיבי 10x ו 60x מוצגים תמונה 1. תיוג סלקטיבית של מסופי דופאמין יכול להיות destained ידי אמפטמין 20 מיקרומטר.
איור 2 מראה destaining של תיוג FFN511 ידי KCl גבוהה.
איור 3 מראה destaining של תיוג FFN511 על ידי גירוי חשמלי מקומי.
איור 1 FFN511 תוויות מסופי הדופאמין בקליפת המוח, striatal פרוסות לחיות חריפה (A) על ידי סימון FFN511 ב פרוסה חריפה קליפת המוח, striatal לחיות:.. תיוג בשפע בסטריאטום (STR), תיוג דלילה בקליפת המוח (CTX), ולא התווית corpus callosum (CC). בר סולם:. 100 מיקרומטר (ב) Destaining של FFN511 מ בסטריאטום ידי אמפטמין. לוחות שמאל: לפני אמפטמין, לוחות מימין: לאחר 20 דקות של אמפטמין 20 מיקרומטר. בר קנה מידה: 10 מיקרומטר.
איור 2. Destaining של תיוג FFN511 ידי KCl גבוהה. תיוג FFN511 הוא destained בתוך היישום 2 דקות של 70 מ"מ KCl ב ACSF. בר סולם: 10μm.
איור 3. תדרים תלויי destaining של תיוג FFN511 בסטריאטום. (א) גירוי מקומי על הרץ 4 הביא destaining מן המסופים. גירוי החל t = 0. בר סולם: 5 מיקרומטר (ב) Destaining של FFN511 בבית הרץ 4 הוא Ca 2 + - ותדירות תלויי.. בקרות לא קיבלו גירוי (153 puncta מ 3 פרוסות). Destaining עם קדמיום כלוריד (200 מיקרומטר) היה זהה שולטת unstimulated (475 puncta מתוך 5 פרוסות). עקומות destaining עבור כל תדר גירוי היו בכושר ידי פונקציית הדעיכה יחיד מעריכי ואת מחצית החיים (t 1 / 2) ערכים מחושבים כמו τ x 0.693 (1 הרץ: 765 puncta מתוך 9 פרוסות, 4 Hz: 410 puncta מתוך 7 פרוסות, 20 הרץ: 416 puncta מ 6 פרוסות). נא עיין מיקרוסקופ וידאו מיקרוסקופיה 2-פוטון של destaining FFN511 במהלך exocytosis ב הכנה למוח striatal פרוסה.
Discussion
בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה לדמיין עצבית אופטית באמצעות תחליפי דופמין ניאון. FFN511 הוא הדור הראשון של FFNs פיתחנו. למרות שזה תוכנן על ידי מיקוד טרנספורטר העצבית שלפוחי אוקסידאז (VMAT2) שנושאת נוירוטרנסמיטרים אוקסידאז מן הציטופלסמה לתוך שלפוחית סינפטית, ובמיוחד תוויות מסופי הדופמין בסטריאטום ו קטכולאמינים חזקה ו / או מסופי סרוטונין בקליפת המוח (כפי שמוצג המדע נייר), תקופת העמסה המתאים הוא קריטי עבור סגוליות מאז FFN511 הוא הידרופובי יחסית. מצאנו כי הדגירה של יותר מ 40 דקות תגרום מכתים ספציפי נרחב פרוסות striatal. סגוליות ניתן לקבוע בצורה ישירה על ידי destaining באמצעות ריכוז גבוה של KCl, שאמור לגרום לשחרור FFN בתוך שלפוחית סינפטית תפקודית. חשיפה של הפרוסה על FFN511 עבור פחות מ 15 דקות תגרום אות ניאון חלשה בשל טעינה מספיקה של צבע של המסופים. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים 100μM ADVASEP-7 להסיר את צבען חייב רקמת תאי. צעד זה אינו הכרחי, אבל אם זה מושמט, הפעם כשלון ב ACSF צריך להיות ממושך. לסיכום, בהתאם הכנה שבחרת, תצטרך לשנות את תקופת ריכוז טעינת לקבוע תיוג אופטימלית.
Acknowledgments
ד Sames בזכות הרולד ג & ליילה י Mathers קרן הצדקה ויוזמות של אוניברסיטת קולומביה ב מדע והנדסה.
ד Sames וד זולצר להודות לקרן עבור מק 'נייט מק' נייט חידושים טכנולוגיים פרס Neuroscience
ד זולצר הודות NIDA, NIMH, ואת Picower ומקרנות בין מחלת פרקינסון.
ח תודה אנג NARSAD.
RH אדוארדס מודה ג'יי מייקל פוקס, קרן, פרקינסון הקרן הלאומית, NIDA ו NIMH.
אנו מודים רוברט בורק עבור 6-OHDA זריקות וייעוץ, Sonders סמן לדיון שימושי, Merek סיו עבור תכנות וניתוח הדמיה, ויאן Schmoranzer לקבלת תמיכה טכנית בהגדרת מיקרוסקופיה TIRF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one) | Columbia University - Dalibor Sames Lab | ||
| ADVASEP-7 | CyDex | AR-OA7-005 | |
| RC-27L Recording chamber | Warner Instruments | 64-0375 | |
| PELCO PrepEze 6-Well Holder | Ted Pella, Inc. | 36157-1 | For slice incubation |
| Master-8 pulse stimulator and Iso- Flex stimulus isolator | AMPI |
References
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxi coordinators. , Academic Press. San Diego. (1997).
- Kay, A. R. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 8098-8117 (1999).
- Bamford, N. S. Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals. Neuron. 42, 653-653 (2004).
