Summary
एक नया neurotransmission ऑप्टिकली उपाय फ्लोरोसेंट डोपामाइन analogs का उपयोग का मतलब है.
Abstract
तंत्रिका तंत्र में न्यूरॉन्स के बीच synaptic पुटिका संलयन के दौरान neurotransmitter रिहाई के माध्यम से संकेत संचारित. Neurotransmitter तेज और व्यक्तिगत presynaptic सीधे टर्मिनल से रिहाई का निरीक्षण करने के लिए, हम फ्लोरोसेंट झूठी न्यूरोट्रांसमीटर synaptic पुटिका मोनोअमाइन ट्रांसपोर्टर के लिए substrates के रूप में डिजाइन. छवि striatum में dopamine जारी करने के लिए इन जांच का उपयोग करना, हम कई टिप्पणियों synaptic plasticity के लिए प्रासंगिक बना दिया. हमने पाया है कि synaptic प्रोत्साहन प्रति neurotransmitter रिहा vesicles के अंश उत्तेजना आवृत्ति पर निर्भर था. एक kinetically अलग "आरक्षित" synaptic पुटिका आबादी इन प्रयोगात्मक शर्तों के अधीन नहीं मनाया गया. Presynaptic टर्मिनलों के एक आवृत्ति पर निर्भर विविधता से पता चला था कि D2 dopamine रिसेप्टर्स पर भाग में निर्भर था presynaptic चयन की आवृत्ति पर निर्भर कोडिंग के लिए एक तंत्र का संकेत है.
हुई जांग और निको जी Gubernator इस काम के लिए समान रूप से योगदान दिया.
Protocol
इस विधि में रिपोर्ट अनुसंधान में इस्तेमाल किया गया था Gubernator एट अल, विज्ञान 324 (5933). 1441-1444 (2009) .
1. तीव्र striatal स्लाइस की तैयारी
- तीव्र striatal स्लाइस की तैयारी से पहले, एक आक्सीजन के साथ मिलना कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ASCF) और बर्फ के साथ यह मस्तिष्क निष्कर्षण से पहले कम से कम 15 मिनट के लिए ठंडा होना चाहिए. ACSF बर्फ का ठंडा रखें और विच्छेदन के दौरान oxygenated. ACSF (मिमी): 125 NaCl, KCl 2.5, NaHCO 26 3, CaCl 2 2.4, 1.3 MgSO4, के.एच. 2 4 पीओ 0.3, 10 ग्लूकोज, HEPES 5, पीएच 7.3-7.4, 290-295 mOsm.
- संज्ञाहरण के बिना पुरुष माउस सिर काटना.
- माउस से पूरे मस्तिष्क को निकालें, और यह vibratome vibratome Krazy ® गोंद का उपयोग कर रखा ट्रे पर माउंट. ब्रेन निष्कर्षण और बढ़ते 2 मिनट के भीतर किया जाना चाहिए. इस समय के दौरान, ACSF बर्फ के ठंडे रखने और ऊतकों को स्वस्थ रखने के oxygenated करने के लिए सुनिश्चित करें.
- 1.54 bregma के बीच एक 0.62 250μm मोटाई में राज्याभिषेक striatal मस्तिष्क स्लाइस काटें . तीन पूरे स्लाइस जो फिर एक सुई के साथ 6 आधा स्लाइस में कटौती कर सकते हैं सकता है प्राप्त किया जाएगा.
- जांच लोड करने से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर oxygenated ACSF में मस्तिष्क स्लाइसें सेते हैं. स्लाइसें अच्छा FFN511 लोड हो रहा है प्रदर्शन और टुकड़ा तैयारी के बाद 4 घंटे तक इमेजिंग के लिए सक्रिय रहते हैं.
2. FFN511 लोड हो रहा है
- FFN511 लोड हो रहा है समाधान (में 10μM FFN511 ACSF) तैयार भी 100μM तैयार ACSF में ADVASEP-7. सभी समाधान हौसले से तैयार किया जाना चाहिए और स्लाइस में लोड करने से पहले कम से कम 15 मिनट oxygenated.
- व्यक्तिगत FFN511 लोड हो रहा है समाधान के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए टुकड़ा सेते हैं.
- फिर कमरे के तापमान पर 2 30 मिनट के लिए oxygenated 100μM ACSF ADVASEP-7 में लोड टुकड़ा incubating कोशिकी ऊतक करने के लिए बाध्य डाई को हटा दें . स्लाइस अब कर रहे हैं इमेजिंग के लिए तैयार है.
3. मस्तिष्क स्लाइसें में इमेजिंग FFN511
FFN511 के स्लाइस में इमेजिंग multiphoton खुर्दबीन स्कैनिंग लेजर का उपयोग किया जाता है. हम एक Prairie चरम multiphoton लेजर खुर्दबीन स्कैनिंग का उपयोग कर रहे हैं (हम एक Zeiss LSM 510 NLO multiphoton लेजर खुर्दबीन स्कैनिंग का उपयोग कर रहे थे पहले कुछ परिणाम Zeiss माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त किया गया).
- रिकार्डिंग कक्ष में FFN511 लोड टुकड़ा (आर सी-27L, वार्नर) प्लेस और प्रति मिनट 1-2 मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर oxygenated ACSF के साथ superfuse. फिर टुकड़ा के शीर्ष पर नायलॉन तार के साथ एक प्लैटिनम वीणा जगह के प्रयोग के दौरान आंदोलन कम से कम. आगे आंदोलन को कम से कम करने के लिए, टुकड़ा चैम्बर में कम से कम 10 मिनट के लिए स्थिर करने के लिए इमेजिंग के लिए पहले अनुमति देते हैं.
- कल्पना और एक 10x पानी विसर्जन उद्देश्य के तहत उज्ज्वल क्षेत्र luminescence के साथ पृष्ठीय striatum पता लगाने.
- प्लेस और इस क्षेत्र में स्थिति द्विध्रुवी मुड़ टंगस्टन इलेक्ट्रोड अगर एक उत्तेजना प्रयोग प्रदर्शन. आदर्श इमेजिंग क्षेत्र उत्तेजक द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड के दो सुझावों के बीच में 300 सुक्ष्ममापी के भीतर स्थित है. दृश्य क्षेत्र के केंद्र में इस क्षेत्र रखें.
- छवि FFN511 लेबल एक 63x (0.9 एनए) पानी विसर्जन पराबैंगनी उद्देश्य के तहत striatal टर्मिनलों. FFN511 760 एनएम वर्णक्रमीय भौतिकी और striatal टर्मिनलों के इष्टतम प्रतिदीप्ति से एक माई ताई लेजर के साथ उत्साहित है एक बैंड पास फिल्टर (480-520 एनएम) के माध्यम से देखा है. छवियाँ x 75 75 512 x 512 पिक्सेल संकल्प पर ब्याज की सुक्ष्ममापी क्षेत्रों के साथ 12 बिट प्रारूप में कब्जा कर रहे हैं. उत्तेजित destaining प्रयोगों के लिए, z-अक्ष पाली, 5-7 छवियों का एक z-श्रृंखला, z विमान में 1 सुक्ष्ममापी द्वारा अलग, के लिए क्षतिपूर्ति प्रत्येक समय अवधि के लिए प्राप्त की है.
4. FFN511 Destaining
FFN511 लेबल KCl के उच्च एकाग्रता (हम 70 मिमी KCl का उपयोग करें), (+) एम्फ़ैटेमिन सल्फेट (AMPH, 20 सुक्ष्ममापी), या बिजली की उत्तेजना के द्वारा या तो destained कर सकते हैं. KCl destaining प्रयोग है, जब एक उच्च पोटेशियम ACSF समाधान मस्तिष्क टुकड़ा करने के लिए लागू किया जाता है, 2 मिनट के भीतर FFN511 लेबल destains. कीर्तिमान xyz टी छवियों के लिए समय पर FFN511 destaining ट्रैक. निम्नलिखित बिजली निर्भर उत्तेजना डोपामाइन टर्मिनल destaining वर्णन:
- समय पर FFN511 destaining ट्रैक करने के लिए, xyz-टी छवियों को दर्ज कर रहे हैं. उत्तेजना के पहले कम से कम 5 मिनट के लिए टुकड़ा (z-अक्ष में कम से कम 4 सुक्ष्ममापी) का न्यूनतम आंदोलन को सुनिश्चित करने के लिए और कोई लेजर, Z-ढेर के नियंत्रण समय श्रृंखला छवियों द्वारा photobleaching प्राप्त होना चाहिए. अन्यथा, लेजर बिजली समायोजित करें.
- इन नियंत्रण छवियों के बाद, xyz-टी इमेजिंग जारी जबकि 1 की आवृत्तियों, 4 या 20 हर्ट्ज पर उत्तेजना शुरू. 1, 4 या 20 हर्ट्ज (300 μs x 1 मा) उत्तेजनाओं striatum स्थानीय एक ISO-फ्लेक्स उत्तेजना एक मास्टर-8 पल्स (AMPI, यरूशलेम, इसराइल) द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड का उपयोग जनरेटर द्वारा ट्रिगर अलगाने द्वारा लागू कर रहे हैं. कम से कम करने के लिएविज्ञप्ति जारी की साइटों के विध्रुवण में भिन्नता है, हम एक उत्तेजना प्रोटोकॉल चक्रीय voltammetry द्वारा निर्धारित अधिकतम उत्तेजना तीव्रता के 150% लागू करने का इस्तेमाल किया है.
- इमेजिंग विश्लेषण के लिए उचित सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें. हमारी प्रयोगशाला में, हम का उपयोग करने के लिए छवि (वेन Rosband, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के, रॉकविल, एमडी) जम्मू और कस्टम लिखा सॉफ्टवेयर (रिसर्च सिस्टम्स, बोल्डर, CO) आईडीएल में time3 साथ puncta प्रतिदीप्ति और परिवर्तन यों.
Represenative परिणाम
चित्रा 1 से पता चलता है striatal टुकड़ा में FFN511 लोड हो रहा है अब पूरा हो गया. प्रतिनिधि छवियों का उपयोग कर 10x और 60x उद्देश्य Fig.1 में दिखाया जाता है. dopamine टर्मिनलों के चुनिंदा लेबलिंग 20 सुक्ष्ममापी एम्फ़ैटेमिन द्वारा destained जा सकता है.
चित्रा 2 से पता चलता है उच्च KCl द्वारा FFN511 लेबलिंग के destaining.
3 स्थानीय बिजली की उत्तेजना के द्वारा FFN511 लेबलिंग की destaining से पता चलता है चित्रा.
चित्रा 1 रहते हैं cortical striatal तीव्र स्लाइस में FFN511 तीव्र रहते टुकड़ा cortical-striatal में डोपामाइन टर्मिनल (ए) द्वारा FFN511 लेबल लेबल: striatum में प्रचुर मात्रा में लेबलिंग (STR), प्रांतस्था में sparser लेबलिंग (CTX), और कोई लेबल में. महासंयोजिका (सीसी). स्केल पट्टी: 100 सुक्ष्ममापी एम्फ़ैटेमिन द्वारा striatum से (बी) के FFN511 Destaining. वाम पैनल: एम्फ़ैटेमिन से पहले, सही पैनल: 20 सुक्ष्ममापी एम्फ़ैटेमिन के 20 मिनट के बाद. स्केल पट्टी: 10 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 2 उच्च KCl द्वारा FFN511 लेबलिंग के Destaining. FFN511 लेबलिंग 70 मिमी KCl ACSF में दो मिनट आवेदन के भीतर destained है. स्केल पट्टी: 10μm.
चित्रा 3 striatum में FFN511 लेबलिंग की आवृत्ति पर निर्भर destaining. (ए) 4 हर्ट्ज पर स्थानीय उत्तेजना टर्मिनलों से destaining में हुई. उत्तेजना t = 0 पर शुरू हुआ. स्केल पट्टी: 5 सुक्ष्ममापी (बी) FFN511 के 4 हर्ट्ज पर Destaining 2 Ca + - और आवृत्ति निर्भर है. . नियंत्रण कोई उत्तेजना (3 स्लाइस से 153 puncta) प्राप्त किया. कैडमियम क्लोराइड (200 सुक्ष्ममापी) के साथ Destaining unstimulated नियंत्रण (5 स्लाइस से 475 puncta) के लिए समान था. destaining घटता प्रत्येक उत्तेजना आवृत्ति के लिए एक घातीय क्षय समारोह और आधा जीवन (1 / 2 टी) से फिट किया गया के रूप में परिकलित मानों τ .693 x (1 हर्ट्ज: 9 स्लाइस, 4 हर्ट्ज से 765 puncta: 7 स्लाइस से 410 puncta : 20 हर्ट्ज से 416 puncta 6) स्लाइस. कृपया एक striatal मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी में exocytosis FFN511 destaining के दौरान 2-photon माइक्रोस्कोपी से वीडियो माइक्रोग्राफ देखें.
Discussion
इस वीडियो में, हम विधि neurotransmission ऑप्टिकली कल्पना फ्लोरोसेंट डोपामाइन analogs का उपयोग कर प्रदर्शित करता है. FFN511 FFNs की पहली पीढ़ी के हम विकसित किया है. हालांकि यह neuronal vesicular मोनोअमाइन (VMAT2) ट्रांसपोर्टर (कि synaptic vesicles में cytoplasm से monoamine न्यूरोट्रांसमीटर किया जाता है, और विशेष रूप से प्रांतस्था में माना catecholamine और / या serotonin के टर्मिनलों striatum में dopamine टर्मिनलों लेबल के रूप में विज्ञान में दिखाया गया है लक्ष्यीकरण द्वारा डिजाइन किया गया था कागज), एक उचित लोड हो रहा है अवधि विशिष्टता के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि FFN511 अपेक्षाकृत hydrophobic है. हमने पाया है कि 40 मिनट से अधिक समय के लिए ऊष्मायन striatal स्लाइस में व्यापक nonspecific धुंधला में परिणाम देगा. विशिष्टता straightforwardly KCl के एक उच्च एकाग्रता है, जो कार्यात्मक synaptic vesicles भीतर FFN की रिहाई के कारण होना चाहिए का उपयोग destaining द्वारा निर्धारित किया जा सकता है है. कम से कम 15 मिनट के लिए FFN511 टुकड़ा के एक्सपोजर टर्मिनलों में डाई की अपर्याप्त लोडिंग के कारण कमजोर फ्लोरोसेंट संकेत में परिणाम देगा. इस प्रोटोकॉल में, हम 100μM ADVASEP-7 का उपयोग करने के लिए कोशिकी ऊतक करने के लिए बाध्य डाई हटायें. यह चरण आवश्यक नहीं है, लेकिन यदि इसे छोड़ा जाता है, ACSF में वार्शआउट समय के लिए लंबे समय तक की जरूरत है. सारांश में, तैयारी तुम चुना पर निर्भर करता है, तो आप एकाग्रता और लदान की अवधि को संशोधित करने के लिए इष्टतम लेबलिंग निर्धारित की आवश्यकता होगी.
Acknowledgments
डी. Sames धन्यवाद जी हेरोल्ड और लीला वाई चैरिटेबल फाउंडेशन और कोलंबिया विश्वविद्यालय के विज्ञान और इंजीनियरिंग में पहल मैथेर्स.
डी. Sames और डी. Sulzer McKnight प्रौद्योगिकी नवाचार के लिए तंत्रिका विज्ञान पुरस्कार में McKnight फाउंडेशन धन्यवाद
डी. Sulzer NIDA, NIMH, और Picower और पार्किंसंस रोग मूलाधार धन्यवाद.
एच. जांग धन्यवाद NARSAD.
आरएच एडवर्ड्स माइकल जे फॉक्स फाउंडेशन, राष्ट्रीय पार्किंसंस फाउंडेशन, NIDA और NIMH धन्यवाद.
हम 6 OHDA इंजेक्शन और सलाह, मार्क उपयोगी चर्चा इमेजिंग विश्लेषण प्रोग्रामिंग के लिए Merek Siu के लिए Sonders, और जनवरी Schmoranzer के लिए TIRF माइक्रोस्कोपी सेटअप के साथ तकनीकी सहायता के लिए रॉबर्ट बर्क धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one) | Columbia University - Dalibor Sames Lab | ||
| ADVASEP-7 | CyDex | AR-OA7-005 | |
| RC-27L Recording chamber | Warner Instruments | 64-0375 | |
| PELCO PrepEze 6-Well Holder | Ted Pella, Inc. | 36157-1 | For slice incubation |
| Master-8 pulse stimulator and Iso- Flex stimulus isolator | AMPI |
References
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxi coordinators. , Academic Press. San Diego. (1997).
- Kay, A. R. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 8098-8117 (1999).
- Bamford, N. S. Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals. Neuron. 42, 653-653 (2004).
