Summary
الأوعية الدموية ، يرتبط تنتشر الأوعية الدموية من الأوعية الدموية الموجودة من قبل ، مع كل من العمليات الطبيعية والمرضية. نحن هنا تدل على وجود عصابة مقايسة الأبهر الذي يسمح potentiators عائية ومثبطات المضافة مباشرة إلى حلقات الأبهر في الثقافة. تنتشر ويمكن تحديدها عن طريق التفتيش ثمرة neovessel الحلقات الأبهر على مدى فترة من 6-12 أيام.
Abstract
الأوعية الدموية ، يرتبط تنتشر الأوعية الدموية من الأوعية الدموية الموجودة مسبقا مع كل من العمليات الطبيعية والمرضية. المقايسات الأوعية الدموية المختلفة تنطوي على دراسة الخلايا البطانية في ظروف الثقافة الفردية (1). في مقايسة حلقة الأبهر هو نموذج الأوعية الدموية التي تقوم على الثقافة الجهاز. في هذا الاختبار والأوعية عائية تنمو من شريحة من الشريان الأبهر (معدلة من (2)). باختصار ، هو استئصاله الماوس الأبهر الصدري ، تتم إزالة طبقة الدهون والبرانية ، ونحن على استعداد الحلقات ما يقرب من 1 ملم في الطول. هي جزء لا يتجزأ ثم حلقات الفردية في قبة صغيرة من مادة صلبة استخراج مصفوفة الطابق السفلي (BME) ، ويلقي داخل الآبار الفردية لوحة 48 - جيدا. يمكن أن تكون عوامل وعائية مثبطات تكوين الأوعية الدموية وأضاف مباشرة إلى الحلقات ، ويمكن استخدام مختلط يشارك في حلقات ثقافة الأبهر وأنواع الخلايا الأخرى لدراسة الآثار نظير الصماوي عائية. ومن الملاحظ تنتشر عن طريق التفتيش تحت stereomicroscope على مدى فترة من 6-12 أيام. ينصح بشدة بسبب الاختلاف الكبير الناجم عن مخالفات في قطاعات الأبهري ، والتجريب في plicates - 6. ويتم رصد جميع أنحاء Neovessel ثمرة التجربة وتصويرها باستخدام المجهر المرحلة ، ويتم جمع supernatants لقياس العوامل ذات الصلة وعائية المضادة عائية ، علامات موت الخلايا والنتريت.
Protocol
قبل يوم واحد من التجربة :
- تسمح BME (خفض عامل النمو ، Cultrex ، Trevigen) لذوبان الجليد على الجليد أو على 4 درجات مئوية ؛ إذابة الجليد مرة واحدة يبقي على منع اعادة ترسيخ.
يوم من التجربة :
- الفئران (6-7 أسابيع من العمر) وسيتم تخدير ونزفت بها.
- إزالة الأبهر الصدري في طبق بتري معقمة مليئة PBS الباردة.
- أداء التنظيف الميكانيكية من الأنسجة المحيطة الدهون. علما ، وتجنب تجفيف الأبهر في أي وقت.
- استخدام شفرة جراحية ، شريحة الأورطي بالتساوي إلى حلقات 1 مم. يجب أن تكون موحدة وخفض نظيفة.
- نقل حلقات لبرنامج تلفزيوني الباردة العذبة والحفاظ على الجليد في جميع الأوقات.
- نصائح قبل استخدام ماصة المبردة ، إضافة إلى كل بئر في صفيحة ال 48 أيضا انخفاضا مقربة من BME 150 مل الباردة. السماح للهبوط BME لترسيخ عند 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة.
- حلقة الأبهر مكان واحد في مركز أعلى كل قبة. احتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- على رأس كل حلقة تضيف BME 150 مل. احتضان لمدة 20-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- إعداد المتوسط : البطانية مصل الإنسان المتوسطة الحرة (GIBCO ، كارلسباد ، كاليفورنيا) تستكمل مع FCS 2 ٪ ، والوحدات 50 / البنسلين مل و 50 ميكروغرام / مل الستربتوميسين (Cellgro).
- إضافة إلى كل من 500 مل تحتوي المتوسطة إما :
- عينات تجريبية.
- الإيجابية التحكم : غشائي تكملة نمو الخلية (رسم القلب ، وتركيز النهائي 200 ميكروغرام / لتر ، العلوم البيولوجية دينار بحريني).
- السيطرة السلبية : متوسطة وحدها.
- لوحة احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 12 يوما ، وخواتم صورة بين 6 و 12 يوما بموجب معيار المرحلة المجسام التباين.
- اختياري : جمع supernatants.
ملاحظات :
- إبقاء ظروف معقمة في كل الأوقات.
- تجنب إدخال فقاعات في BME.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأبهر مقايسة الدائري هو أداة مفيدة على طريقة لتقييم عائية وكذلك العوامل المضادة للعائية. السفن التي تنبثق من حلقات الأبهر تجنيد خلايا العضلات الملساء وpericytes اقترانه الأنبوب الخلية البطانية ، وهذا يعني أنها تشبه تشريحيا إلى neovessels في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، الحلبة الأبهر مقايسة الماوس يحمل الاستفادة من مجموعة واسعة من الأدوات المتاحة لهذا المعدلة وراثيا الأنواع. ومع ذلك ، هناك مساوئ عديدة لفحص رنين الأبهر. الأولى ، ثمرة السفن في الجسم الحي من microvessels يحدث وليس من السفن الكبرى مثل الشريان الأورطي. ثانيا ، يمكن للتناقض في التعامل مع عصابات وكمية الأنسجة المحيطة المتبقية على متن السفينة تأثير ثمرة السفينة. ويمكن من حلقات aortas مختلف الأعمار أو الفئران مختلفة وسلالات تتداخل أيضا مع الاستجابات عائية. وأخيرا ، ثمرة سفينة عائية يحدث في ثلاثة أبعاد ، مما يجعل من غير مثالية لتصوير وقياس. أخذت معا ، وعندما أجريت مع وجود ضوابط داخلية كافية ويكرر متعددة ، وهذا الفحص بسيط نسبيا ، وغير مكلفة ، الزاخرة بالمعلومات ومتفوقة بشكل كبير على الثقافات البطانية في تعقيدها وأهميتها البيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular Research. 74, 172-183 (2007).
- Masson, V., Devy, L., Grignet-Debrus, C., Bernt, S., Bajou, K., Blacher, S., Roland, G., Chang, Y., Fong, T., Carmeliet, P., Foidart, J. M., Noel, A. Mouse aortic ring assay: a new approach of the molecular genetics of angiogenesis. Biol. Proced. Online. 4, 24-31 (2002).
