Summary
Angiogenesis, पूर्व मौजूदा vasculature से रक्त वाहिकाओं के अंकुरण, दोनों प्राकृतिक और रोग प्रक्रियाओं के साथ जुड़ा हुआ है. यहाँ हम एक महाधमनी अंगूठी परख है कि angiogenic potentiators और inhibitors के सीधे संस्कृति में महाधमनी के छल्ले को जोडी देता प्रदर्शित करता है. अंकुरित और neovessel परिणाम 6-12 दिनों की अवधि में महाधमनी के छल्ले निरीक्षण द्वारा निर्धारित किया जा सकता है है.
Abstract
Angiogenesis, preexisting vasculature से रक्त वाहिकाओं के अंकुरण दोनों प्राकृतिक और रोग प्रक्रियाओं के साथ जुड़ा हुआ है. विभिन्न angiogenesis assays संस्कृति शर्तों (1) में व्यक्तिगत endothelial कोशिकाओं का अध्ययन शामिल है. महाधमनी अंगूठी परख एक angiogenesis के मॉडल है कि अंग संस्कृति पर आधारित है. इस परख में, angiogenic वाहिकाओं महाधमनी ((2) से संशोधित) के खंड से बढ़ता है. संक्षेप में, माउस वक्ष महाधमनी excised है, वसा परत और adventitia निकाल रहे हैं, और लंबाई में लगभग 1 मिमी के छल्ले तैयार हैं. व्यक्तिगत छल्ले तब तहखाने मैट्रिक्स (BME) निकालने, 48 अच्छी तरह से एक थाली के अलग - अलग कुओं के अंदर डाली के एक छोटे से ठोस गुंबद में एम्बेडेड रहे हैं. Angiogenic कारकों और के angiogenesis inhibitors के छल्ले को सीधे जोड़ा जा सकता है, और महाधमनी के छल्ले और अन्य प्रकार की कोशिकाओं के एक मिश्रित संस्कृति सह paracrine angiogenic प्रभाव के अध्ययन के लिए नियोजित किया जा सकता है. अंकुरित निरीक्षण stereomicroscope के तहत 6-12 दिनों की अवधि में मनाया जाता है. बड़े 6-plicates महाधमनी क्षेत्रों, प्रयोग में अनियमितताओं की वजह से भिन्नता के कारण जोरदार की सलाह दी है. Neovessel परिणाम प्रयोग और imaged चरण माइक्रोस्कोपी का उपयोग के दौरान निगरानी की है, और supernatants प्रासंगिक angiogenic और विरोधी angiogenic कारकों, कोशिका मृत्यु मार्करों और नाइट्राइट की माप के लिए एकत्र कर रहे हैं.
Protocol
प्रयोग से पहले एक दिन:
- BME (कम वृद्धि कारक, Cultrex, Trevigen) बर्फ पर या 4 में पिघलना करने के लिए अनुमति दें डिग्री सेल्सियस, एक बार thawed बर्फ पर रखने के लिए फिर से solidifying को रोकने.
प्रयोग के दिन:
- चूहे (6-7 पुराने सप्ताह) के लिए anesthetized और बाहर लहूलुहान कर रहे हैं.
- ठंड बाँझ पीबीएस के साथ भरा एक पेट्री डिश में वक्ष महाधमनी निकालें.
- वसा ऊतकों आसपास से यांत्रिक सफाई प्रदर्शन. नोट: किसी भी समय महाधमनी के सूखने से बचने के.
- एक सर्जिकल ब्लेड का प्रयोग, महाधमनी समान रूप से टुकड़ा 1 मिमी के छल्ले में. कटौती वर्दी और साफ होना चाहिए.
- ताजा ठंड पीबीएस के छल्ले स्थानांतरण और सभी समय पर बर्फ पर रखने.
- पूर्व ठंडा विंदुक युक्तियाँ का प्रयोग, एक 48 अच्छी तरह से थाली 150 मिलीलीटर ठंड BME के एक गोल ड्रॉप में एक अच्छी तरह से जोड़ने के. BME ड्रॉप 37 पर जमना ° सी 20-30 मिनट के लिए अनुमति दें.
- प्रत्येक गुंबद के शीर्ष केंद्र में एक एकल महाधमनी अंगूठी रखें. 37 पर 10 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
- प्रत्येक अंगूठी के शीर्ष पर एक अतिरिक्त 150 मिलीलीटर BME जोड़ें. 37 पर 20-30 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
- मध्यम तैयार: मानव endothelial सीरम मुक्त माध्यम (GIBCO, Carlsbad, CA) FCS 2%, 50 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन और 50 स्ट्रेप्टोमाइसिन μg / मिलीलीटर (Cellgro) के साथ पूरक है.
- अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 500 मिलीलीटर या तो युक्त मध्यम जोड़ने:
- प्रायोगिक नमूने.
- सकारात्मक नियंत्रण: Endothelial सेल के विकास के पूरक (ECGs, अंतिम 200 / μg मिलीलीटर एकाग्रता, बी.डी. बायोसाइंसेज).
- नकारात्मक नियंत्रण: मध्यम अकेले.
- 37 में सेते थाली ° सी, 12 दिनों के लिए 6 दिन और 12 के बीच मानक चरण विपरीत त्रिविमेक्ष तहत तस्वीर के छल्ले.
- वैकल्पिक: supernatants लीजिए.
नोट:
- सभी समय बाँझ शर्तों रखें.
- BME में बुलबुले की शुरूआत से बचें.
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Discussion
महाधमनी अंगूठी परख angiogenic के रूप में विरोधी angiogenic कारकों के रूप में अच्छी तरह से मूल्यांकन करने के लिए अपने रास्ते पर एक लाभदायक उपकरण है. वाहिकाओं है कि महाधमनी के छल्ले भर्ती चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और pericytes से बाहर हो जाना करने के लिए endothelial सेल ट्यूब के साथ संबद्ध है, जिसका अर्थ है कि वे anatomically vivo में neovessels करने के लिए समान हैं. इसके अलावा, माउस महाधमनी अंगूठी परख ट्रांसजेनिक इस प्रजाति के लिए उपलब्ध उपकरणों की विशाल सरणी का लाभ रखती है. फिर भी, वहाँ महाधमनी अंगूठी परख के लिए कई नुकसान कर रहे हैं. सबसे पहले, vivo में जहाजों microvessels से परिणाम और महाधमनी जैसे प्रमुख वाहिकाओं से नहीं होता है. दूसरा छल्ले के संचालन में विसंगति है और पोत पर शेष ऊतक के आसपास की राशि पोत परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं. अलग aortas या अलग है चूहों की उम्र और उपभेदों से रिंगों भी angiogenic प्रतिक्रियाओं के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. और अंत में, angiogenic पोत परिणाम तीन आयामों, जो यह गैर आदर्श तस्वीर और यों में होता है. साथ में ले ली, जब पर्याप्त आंतरिक नियंत्रण के साथ और कई को दोहराता के साथ प्रदर्शन किया, इस परख अपेक्षाकृत सरल, गैर महंगा, अत्यधिक जानकारीपूर्ण और काफी अपनी जैविक जटिलता और प्रासंगिकता में endothelial संस्कृतियों से बेहतर है.
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References
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular Research. 74, 172-183 (2007).
- Masson, V., Devy, L., Grignet-Debrus, C., Bernt, S., Bajou, K., Blacher, S., Roland, G., Chang, Y., Fong, T., Carmeliet, P., Foidart, J. M., Noel, A. Mouse aortic ring assay: a new approach of the molecular genetics of angiogenesis. Biol. Proced. Online. 4, 24-31 (2002).
