Summary
Angiogenesis는, 기존 vasculature의 혈관이 돋아는 자연과 병리 학적 프로세스를 모두와 연결되어 있습니다. 여기 angiogenic potentiators와 억제제가 직접 문화에 대동맥 링으로 추가할 수 대동맥 고리 분석을 보여줍니다. 돋아 및 neovessel의 파생물은 6-12 일 기간 동안 대동맥 고리를 조사하여 결정하실 수 있습니다.
Abstract
Angiogenesis는 전부터 vasculature의 혈관이 돋아는 자연과 병리 학적 프로세스를 모두와 연결되어 있습니다. 다양한 angiogenesis assays의 문화의 조건 (1)에서 개별 내피 세포의 연구를 포함하고 있습니다. 대동맥 링 분석은 장기 문화를 기반으로 angiogenesis 모델입니다. 이 분석에서는 angiogenic 선박 대동맥 ((2)에서 수정)의 세그먼트에서 성장. 간단히 마우스 흉부 대동맥이 excised이며, 지방 레이어와 adventitia 제거하고, 고리 길이 약 1mm가 준비가되어 있습니다. 개인 고리는 다음 48 잘 접시의 각각의 우물 안으로 캐스팅 지하 매트릭스 추출 (BME)의 작은 고체 돔에 포함됩니다. Angiogenic 요소와 angiogenesis의 억제제 직접 고리에 추가 될 수 있으며, 대동맥 고리와 다른 세포 유형의 혼합 공동 문화 paracrine angiogenic 효과 연구에 대한 고용 수 있습니다. 돋아은 6-12 일 기간 동안 stereomicroscope 이하 검사로 관찰합니다. 6 plicates의 대동맥 세그먼트 실험에서 부정으로 인한 큰 변화로 인해 적극 권장합니다. Neovessel의 가지는 위상 현미경을 사용하여 실험을하고 몇 군데에 걸쳐 모니터링하고, supernatants는 관련 angiogenic 및 안티 angiogenic 요인, 세포 사망 마커 및 아질산염의 측정을 위해 수집됩니다.
Protocol
실험 하루 전에 :
- BME가 (감소 성장 인자, Cultrex, Trevigen) 얼음이나 4에 해동을 허용 ° C, 한번 다시 응고를 방지하기 위해 얼음 계속 해동.
실험 일 :
- 마우스 (오래된 6~7주)은 anesthetized하고 출혈하는 것입니다.
- 감기 멸균 PBS 가득한 페트리 접시에 흉부 대동맥을 제거합니다.
- 지방 조직 주변에서 기계 청소를 수행합니다. 참고 언제든지 대동맥의 건조하지 마십시오.
- 수술 칼날을 사용하여, 1mm의 고리에 균등하게 대동맥을 슬라이스. 상처가 균일하고 깨끗하게해야합니다.
- 신선한 차가운 PBS로 반지를 전송하고 항상 얼음에 보관.
- 사전 냉각 피펫 팁을 사용하여 48 자 판 150 ML 감기 BME의 둥근 방울의 각 잘 추가할 수 있습니다. 37 응고에 BME 드롭 ° 20~30분 C를 허용합니다.
- 각 돔의 상단 중앙에 하나의 대동맥 반지를 놓습니다. 37 10 분 품어 ° C.
- 각 링 위에 추가 150 ML의 BME를 추가합니다. 37 20~30분에 대한 품어 ° C.
- 매체 준비 : 인간 내피 혈청 무료 매체 (GIBCO, 칼스 배드, CA) 2% FCS, 50 단위 / ML 페니실린 50 μg / ML 스트렙토 마이신 (Cellgro)과 보완.
- 각 역시 포함 500 ML 매체를 추가하십시오
- 실험 샘플.
- 긍정적인 제어 : 내피 세포 성장 보완 (ECGS, 최종 농도가 200 μg / ML, BD Biosciences).
- 대조군 : 혼자 중간.
- 37 품어 판 ° 12 일 동안 C 표준 위상 콘트라스트 입체경 미만 일 6 12 일까지 사진 반지.
- 옵션 : supernatants를 수집합니다.
참고 :
- 항상 살균 조건을 유지.
- BME에 거품 도입하지 마십시오.
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Discussion
대동맥 고리 분석은 물론 안티 angiogenic 요인으로 angiogenic 평가할 수있는 방법에 유익한 도구입니다. 그들은 생체내에 neovessels에 해부학적인 몸의 구조와 유사한 것을 의미 내피 세포 튜브와 연결하는 대동맥 고리 모집 평활근 세포와 pericytes에서 밖으로 성장 선박. 또한, 마우스 대동맥 링 분석이 종족에 대한 가능한 유전자 변형 도구의 광대한 배열의 장점을 보유하고 있습니다. 그러나, 대동맥 고리 분석 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, 생체내에서 선박의 파생물은 microvessels에서가 아니라 같은 대동맥 같은 주요 혈관에서 발생합니다. 둘째, 반지의 처리에 일관성 및 선박에 남아있는 조직이 주변의 금액은 선박 가지 영향을 미칠 수있다. 다른 aortas하거나 다른 마우스의 연령과 계통의 반지는 또한 angiogenic 반응을 방해할 수 있습니다. 그리고 마지막으로, Angiogenic 선박 가지가 아닌 이상 사진과 수치하게 삼차원에 발생합니다. 함께 촬영, 충분한 내부 통제와 여러 반복 수행할 때,이 분석은 비교적 간단하고 비용이 아닌, 매우 유익하고 그 생물 학적 복잡 성과 관련에서 내피 문화 상당히 우수합니다.
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References
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular Research. 74, 172-183 (2007).
- Masson, V., Devy, L., Grignet-Debrus, C., Bernt, S., Bajou, K., Blacher, S., Roland, G., Chang, Y., Fong, T., Carmeliet, P., Foidart, J. M., Noel, A. Mouse aortic ring assay: a new approach of the molecular genetics of angiogenesis. Biol. Proced. Online. 4, 24-31 (2002).
