Summary
La angiogénesis, el surgimiento de los vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes, se asocia con procesos naturales y patológicos. Aquí se demuestra un ensayo de anillo aórtico que permite a los potenciadores e inhibidores de la angiogénesis que se añade directamente a los anillos de la aorta en la cultura. Surgimiento y extensión de neovasos se puede determinar mediante la inspección de los anillos de aorta en un período de 6-12 días.
Abstract
La angiogénesis, el surgimiento de los vasos sanguíneos de la vasculatura preexistente se asocia con procesos naturales y patológicos. Diversos ensayos angiogénesis involucran el estudio de cada uno de las células endoteliales en condiciones de cultivo (1). El ensayo de anillo aórtico es un modelo de angiogénesis que se basa en el cultivo de órganos. En este ensayo, vasos angiogénicos crecer a partir de un segmento de la aorta (modificado a partir de (2)). En pocas palabras, la aorta torácica del ratón se extirpa la capa de grasa y la adventicia se retiran, y los anillos de aproximadamente 1 mm de largo están preparadas. Anillos individuales se incrusta en una pequeña cúpula sólida de extraer el sótano de la matriz (BME), emitidos dentro de pozos individuales de una placa de 48 pocillos. Factores angiogénicos y los inhibidores de la angiogénesis se puede añadir directamente a los anillos, y una mezcla de co-cultivo de los anillos aórticos y otros tipos de células pueden ser empleadas para el estudio de los efectos paracrinos angiogénicos. Brotación se observa por la inspección bajo un microscopio estereoscópico en un período de 6-12 días. Debido a la gran variación causada por las irregularidades en los segmentos de la aorta, la experimentación de 6 plicates es muy recomendable. Consecuencia de neovasos se controla a través del experimento y la imagen por microscopía de fase, y los sobrenadantes se recogen para la medición de los factores relevantes angiogénicos y anti-angiogénicos, los marcadores de muerte celular y el nitrito.
Protocol
Un día antes del experimento:
- Permitir BME (factor de crecimiento reducido, Cultrex ®, Trevigen) para descongelar el hielo oa 4 ° C, una vez descongelado mantener en hielo para evitar que vuelva a solidificar.
Día del experimento:
- Ratones (6-7 semanas de edad) se anestesiaron y se desangró.
- Retire la aorta torácica en una placa de Petri llena con PBS frío estéril.
- Realizar la limpieza mecánica de los tejidos circundantes grasa. Tenga en cuenta, evitar la desecación de la aorta en cualquier momento.
- Usando una hoja de bisturí, cortar la aorta de manera uniforme en anillos 1 mm. El corte debe ser uniforme y limpia.
- La transferencia de los anillos de PBS frío y mantener en hielo en todo momento.
- Utilizando puntas de pipeta de pre-enfriado, añadir a cada pocillo en una placa de 48 pocillos una gota redonda de 150 ml BME frío. Permitir la caída de BME para solidificar a 37 ° C durante 20-30 minutos.
- Colocar un anillo aórtico único por el centro de cada domo. Incubar durante 10 minutos a 37 ° C.
- En la parte superior de cada aro agrega un adicional de 150 ml BME. Incubar durante 20-30 minutos a 37 ° C.
- Preparar el medio: endoteliales humanas medio libre de suero (GIBCO, Carlsbad, CA) suplementado con 2% FCS, 50 unidades / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina (Cellgro).
- A cada pocillo se añaden 500 ml de medio que contienen:
- Muestras experimentales.
- Control positivo: suplemento de crecimiento endotelial (ECG, la concentración final de 200 mg / ml, BD Biosciences).
- Control negativo: el medio solo.
- La placa se incuba a 37 ° C durante 12 días, los anillos de fotografía entre los días 6 y 12 bajo estereoscopio nivel de contraste de fase.
- Opcional: Recoge sobrenadantes.
Notas:
- Mantener condiciones estériles en todo momento.
- Evitar la introducción de burbujas en el BME.
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Discussion
Ensayo de anillo aórtico es una herramienta útil en la forma de evaluar angiogénicos y anti-angiogénicos factores. Los vasos sanguíneos que crecen fuera de los anillos aórticos reclutar células musculares lisas y pericitos de asociarse con el tubo de las células endoteliales, lo que significa que son anatómicamente similares a los neovasos en vivo. Además, la aorta del ratón ensayo de anillo tiene la ventaja de la amplia gama de herramientas de transgénicos disponibles para esta especie. Sin embargo, hay varios inconvenientes a la prueba del anillo aórtico. En primer lugar, consecuencia vasos in vivo se produce a partir de microvasos y no de los grandes vasos como la aorta. Inconsistencia en segundo lugar, en el manejo de los anillos y la cantidad de tejido circundante queda en el buque puede influir en consecuencia buque. Anillos de aorta diferentes edades diferentes ratones y las cepas también pueden interferir con la respuesta angiogénica. Y, por último, vasos angiogénicos consecuencia se produce en tres dimensiones, lo que hace que no sea ideal para la fotografía y cuantificar. En su conjunto, cuando se realiza con suficientes controles internos y con múltiples repeticiones, este ensayo es relativamente simple, no costoso, muy informativo y significativamente superior a las culturas del endotelio en su complejidad biológica y su pertinencia.
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References
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular Research. 74, 172-183 (2007).
- Masson, V., Devy, L., Grignet-Debrus, C., Bernt, S., Bajou, K., Blacher, S., Roland, G., Chang, Y., Fong, T., Carmeliet, P., Foidart, J. M., Noel, A. Mouse aortic ring assay: a new approach of the molecular genetics of angiogenesis. Biol. Proced. Online. 4, 24-31 (2002).
