Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Aort Halka Testi

Published: November 24, 2009 doi: 10.3791/1564

Summary

Anjiyogenez, önceden mevcut olan damarsal kan damarlarının çimlenme hem de doğal ve patolojik süreçleri ile ilişkilidir. Burada anjiyogenik potentiators ve inhibitörleri doğrudan kültür aort halkalar eklenecek sağlayan bir aort halka tahlil göstermektedir. Çimlenme ve neovessel akıbet aort halkaları 6-12 günlük bir süre içinde inceleyerek tespit edilebilir.

Abstract

Anjiyogenez, önceden var olan damarsal kan damarlarının çimlenme, doğal ve patolojik süreçler ile ilişkilidir. Çeşitli anjiyogenez testleri, kültür koşulları (1), bireysel endotel hücreleri çalışma içerir. Aort halka testi organ kültürü temel alan bir anjiyogenez modeli. Bu testte, anjiyogenik damarları aorta ((2) değiştirilmiş) bir segment büyür. Kısaca, fare torasik aort eksize edilir, yağ tabakası ve adventisya kaldırılır, halkalar yaklaşık 1 mm uzunluğunda hazırlanır. Bireysel halkaları sonra 48 plaka ayrı kuyu içine dökme bodrum matris ekstresi (BME), küçük bir katı kubbe içinde gömülürler. Anjiogenik faktörler ve anjiyogenez inhibitörleri doğrudan halkalar eklenecek ve aort halkaları ve diğer hücre türleri karışık bir ko-kültür, parakrin anjiyogenik etkileri çalışması için istihdam edilebilir. Çimlenme 6-12 günlük bir süre içinde bir stereomikroskop altında incelenmesi ile görülmektedir. 6-lamasını zorlaştırmaktadır aort kesimleri, deneme düzensizlikler neden büyük değişkenlik nedeniyle şiddetle tavsiye edilir. Neovessel akıbet faz mikroskopi kullanılarak deney ve görüntülü boyunca izlenir ve süpernatantlar ilgili anjiyogenik ve anti-anjiogenik faktörler, hücre ölümü işaretleri ve nitrit ölçümü için toplanan.

Protocol

Bir gün önce deney:

  1. BME (düşük büyüme faktörü, Cultrex, Trevigen) Çözülme için izin ver buz üzerinde veya 4 ° C; bir kez yeniden katılaşmasını önlemek için buz üzerinde tutmak çözülmüş.

Deney Gün:

  1. Fare (eski 6-7 hafta), anestezi ve dışarı kanadı için.
  2. Torasik aort soğuk steril PBS ile dolu bir Petri kabı çıkarın.
  3. Çevreleyen yağ dokusu mekanik temizlik yapın. Not, herhangi bir zamanda Aort kurutulması önlemek.
  4. 1 mm halkalar şeklinde bir cerrahi bıçak kullanarak, eşit Aort dilim. Kesilmiş, düzgün ve temiz olmalıdır.
  5. Taze soğuk PBS halkaları transferi ve her zaman buz üzerinde tutmak.
  6. Önceden soğutulmuş pipet uçları kullanarak, her bir kuyunun 48 plaka 150 ml soğuk BME yuvarlak bir damla ekleyin. 37 ° katılaşmaya BME damla ° C 20-30 dakika izin verin.
  7. Her kubbenin üst merkezinde tek bir aort halkası yerleştirin. 37 az 10 dakika boyunca inkübe ° C
  8. Her halka üstüne ek bir 150 ml BME ekleyin. 37 20-30 dakika inkübe ° C
  9. Orta hazırlayın: İnsan endotel serum serbest orta (Gibco, Carlsbad, CA)% 2, 50 adet FCS / ml penisilin ve 50 mg / ml streptomisin (Cellgro) ile desteklenmiştir.
  10. Her biri iyi ya da içeren 500 ml orta ekleyin:
    1. Deney örnekleri.
    2. Pozitif kontrol: Endotel hücre büyümesi ek (EKG, nihai konsantrasyonu 200 mg / ml, BD Biosciences).
    3. Negatif kontrol: Orta yalnız.
  11. Inkübe plaka 37 ° C 12 gün, standart faz kontrast Stereoskop altında 6 ve 12 gün arasında fotoğraf halkaları.
  12. İsteğe bağlı: süpernatantlar toplayın.

Notlar:

  1. Her zaman steril koşullar tutun.
  2. BME baloncuklar giriş kaçının.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aort halka testi yolda anjiyogenik yanı sıra anti-anjiogenik faktörler olarak değerlendirmek için yararlı bir araçtır. In vivo neovessels anatomik olarak benzer olduğu anlamı, endotelyal hücre tüp ile ilişkilendirmek için aort halkaları işe düz kas hücreleri ve perisitlerden dışarı büyümek gemiler. Ayrıca, fare aort halka testi bu tür için transgenik araçlar geniş bir dizi avantajı tutar. Yine de, aort halka tahlil çeşitli dezavantajları vardır. İlk olarak, in vivo damarları akıbet mikrodamarlar ve aort gibi büyük damarlardan oluşur. İkincisi, yüzüklerin ele tutarsızlık ve gemide kalan doku çevresindeki miktarı damar akıbet etkileyebilir. Anjiogenik yanıtları farklı aorta veya farklı farelerin yaş ve suşları yüzükler de engelleyebilir. Ve son olarak, ideal olmayan fotoğraf ve ölçmek için üç boyutlu, anjiyogenik gemi akıbet oluşur. Birlikte ele alındığında, yeterli iç kontrollerin ve birden fazla tekrarlar yapıldığında, bu testte nispeten basit, pahalı olmayan, son derece bilgilendirici ve biyolojik karmaşıklık ve alaka endotel kültürleri önemli ölçüde üstündür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

References

  1. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular Research. 74, 172-183 (2007).
  2. Masson, V., Devy, L., Grignet-Debrus, C., Bernt, S., Bajou, K., Blacher, S., Roland, G., Chang, Y., Fong, T., Carmeliet, P., Foidart, J. M., Noel, A. Mouse aortic ring assay: a new approach of the molecular genetics of angiogenesis. Biol. Proced. Online. 4, 24-31 (2002).

Tags

Tıp Sayı 33 aort halkaları anjiyogenez kan damarları aort fare gemi akıbet
Aort Halka Testi
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Bellacen, K., Lewis, E. C. AorticMore

Bellacen, K., Lewis, E. C. Aortic Ring Assay. J. Vis. Exp. (33), e1564, doi:10.3791/1564 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter