Assay anneau aortique

Summary

L'angiogenèse, la germination des vaisseaux sanguins préexistants vasculaire, est associée à des processus naturels et pathologiques. Ici nous démontrons un test anneau aortique qui permet potentialisateurs angiogéniques et inhibiteurs d'être directement ajoutés à anneaux aortiques dans la culture. La germination et l'excroissance neovessel peut être déterminé en examinant les anneaux aortiques sur une période de 6-12 jours.

Abstract

L'angiogenèse, la germination des vaisseaux sanguins de la vascularisation préexistante est associée à des processus naturels et pathologiques. Dosages différents angiogénèse impliquent l'étude des différentes cellules endothéliales dans des conditions de culture (1). Le test anneau aortique est un modèle angiogenèse qui est basé sur la culture d'organes. Dans cet essai, les vaisseaux angiogéniques croissance d'un segment de l'aorte (modifié d'après (2)). En bref, la souris aorte thoracique est excisée, la couche de graisse et l'adventice sont supprimés, et les anneaux d'environ 1 mm de longueur sont préparés. Anneaux individuels sont ensuite intégrés dans un petit dôme solide extrait de matrice sous-sol (BME), coulé à l'intérieur des puits individuels d'une plaque de 48 puits. Facteurs angiogéniques et inhibiteurs de l'angiogenèse peuvent être directement ajoutés aux anneaux, et un mélange de co-culture des anneaux aortiques et autres types de cellules peuvent être utilisées pour l'étude des effets paracrines angiogéniques. La germination est observée par l'inspection sous un stéréomicroscope sur une période de 6-12 jours. En raison de la grande variation causée par les irrégularités dans les segments de l'aorte, l'expérimentation en 6-plicates est fortement conseillé. Excroissance Neovessel est surveillé durant toute l'expérience et imagée en utilisant la microscopie de phase, et les surnageants sont collectés pour la mesure des facteurs pertinents angiogéniques et anti-angiogéniques, des marqueurs de la mort cellulaire et de nitrite.

Protocol

Un jour avant l'expérience:

1. Autoriser BME (facteur de croissance réduite, Cultrex ®, Trevigen) de dégeler la glace ou à 4 ° C; une fois décongelé garder sur la glace pour prévenir la ré-solidification.

Journée de l'expérience:

1. Souris (6-7 semaines) doivent être anesthésiés et saignés.
2. Retirez l'aorte thoracique dans une boîte de Pétri remplie de PBS stérile à froid.
3. Effectuer le nettoyage mécanique des tissus environnants graisse. Remarque, éviter le dessèchement de l'aorte, à tout moment.
4. En utilisant une lame chirurgicale, tranche l'aorte uniformément dans une anneaux mm. La coupe doit être uniforme et propre.
5. Transfert des anneaux pour frais PBS froid et de garder sur la glace en tout temps.
6. Utiliser des embouts de pipette pré-refroidi, ajouter dans chaque puits dans une plaque de 48 puits une goutte ronde de 150 ml de BME froid. Laisser la goutte BME à se solidifier à 37 ° C pendant 20-30 minutes.
7. Placer un anneau aortique unique en haut au centre de chaque dôme. Incuber 10 minutes à 37 ° C.
8. Le haut de chaque anneau, ajoutez un supplément de 150 ml de BME. Incuber pendant 20-30 minutes à 37 ° C.
9. Préparer le milieu: l'homme endothéliales milieu sans sérum (GIBCO, Carlsbad, CA) supplémenté avec 2% de FCS, 50 unités / ml de pénicilline et 50 pg / ml de streptomycine (Cellgro).
10. Pour chaque puits ajouter 500 ml de milieu contenant soit:
1. Échantillons expérimentaux.
2. Contrôle positif: la croissance des cellules endothéliales complément (ECGS, concentration finale 200 ug / ml, BD Biosciences).
3. Contrôle négatif: le milieu seul.
11. Plaque Incuber à 37 ° C pendant 12 jours, bagues photographie entre 6 et 12 jours sous stéréoscope à contraste de phase standard.
12. En option: Recueillir les surnageants.

Notes:

1. Gardez des conditions stériles en tout temps.
2. Éviter l'introduction de bulles dans le BME.

Discussion

Test anneau aortique est un outil bénéfique sur la façon d'évaluer angiogéniques ainsi que facteurs anti-angiogéniques. Les navires qui poussent à partir des cellules aortiques anneaux de recruter les muscles lisses et des péricytes à associer avec le tube de cellules endothéliales, ce qui signifie qu'ils sont anatomiquement semblables aux néovaisseaux in vivo. Par ailleurs, le dosage anneau aortique de souris détient l'avantage de la vaste gamme d'outils transgéniques disponibles pour cette espèce. Pourtant, il ya plusieurs inconvénients à l'essai anneau aortique. Tout d'abord, excroissance vaisseaux in vivo se produit à partir de microvaisseaux et non pas de vaisseaux importants tels que l'aorte. Deuxièmement, l'incohérence dans la gestion des bagues et le montant des tissus environnants restant sur le navire peut influencer excroissance navire. Les anneaux des aortes différents ou d'âges différentes souris et les souches peuvent aussi interférer avec les réponses angiogéniques. Et enfin, excroissance navire angiogénique survient en trois dimensions, ce qui le rend non-idéal pour photographier et à quantifier. Pris ensemble, une fois exécuté avec suffisamment de contrôles internes et avec plusieurs répétitions, ce test est relativement simple, non coûteux, très instructif et significativement supérieur aux cultures endothéliales dans sa complexité biologique et la pertinence.