Extração de DNA genômico de alto peso molecular de solos e sedimentos

Summary

Uma metodologia para isolar alto peso molecular e DNA genômico de alta qualidade da comunidade microbiana do solo é descrito.

Abstract

O microbioma do solo é um reservatório vasto e relativamente inexplorado da diversidade genômica e inovação metabólica que está intimamente associado com nutrientes e fluxo de energia nos ecossistemas terrestres. Cultivo independente de genômica ambiental, também conhecida como metagenomic, abordagens prometem um acesso sem precedentes a essa informação genética no que diz respeito à reconstrução caminho e triagem funcional para terapêuticas de alto valor e os processos de conversão de biomassa. No entanto, o microbioma solo ainda permanece um desafio em grande parte devido à dificuldade na obtenção de DNA de alto peso molecular de qualidade suficiente para a produção de grandes inserir biblioteca. Aqui nós apresentamos um protocolo para a extração de alto peso molecular, o DNA genômico microbiana comunidade de solos e sedimentos. A qualidade do DNA genômico isolado é ideal para a construção de grandes bibliotecas genômicas inserir ambientais para aplicações a jusante seqüenciamento e análise.

O procedimento começa com a lise celular. Paredes celulares e membranas de micróbios são lisadas por ambas as forças mecânicas (trituração) e químicas (β-mercaptoetanol). DNA genômico é então isolado usando tampão de extração, clorofórmio-álcool isoamílico e álcool isopropílico. Os buffers empregados para a lise e os passos de extração incluem isotiocianato de guanidina e brometo de hexadeciltrimetilamônio (CTAB) para preservar a integridade do DNA genômico de alto peso molecular. Dependendo da sua aplicação a jusante, o DNA genômico isolado pode ser purificado usando cloreto de césio (CsCl) ultracentrifugação de gradiente, o que reduz as impurezas, incluindo os ácidos húmicos. O primeiro procedimento, a extração, leva aproximadamente 8 horas, com exclusão de etapa de quantificação de DNA. A ultracentrifugação gradiente de CsCl, é um processo de dois dias. Durante todo o procedimento, o DNA genômico deve ser tratada com cuidado para evitar corte, evitar vórtex grave e dura pipetagem repetitiva.

Protocol

Parte I: Extração de DNA

Procedimento

1. 8 horas são necessárias, para o processamento de 6 amostras excluindo quantificação de DNA.

Antes de iniciar a extração, você vai precisar de pré-chill morteiro pilão, e espátula em um freezer -20 ° C ou usando nitrogênio líquido. Além disso, pré-chill tubos de 50 ml contendo 20 ml de clorofórmio álcool isoamílico (24:1) no gelo. Definir o forno de hibridação a 65 ° C para pré-aquecer. Verifique solução CTAB, se é cristalizado quente a 60 ° C para derreter os cristais. Completar a solução de desnaturação e tampão de extração, adicionando os ingredientes passada, pouco antes de começar a extração (veja a receita abaixo). Realizar todos os procedimentos de extração em uma capela.

2. Preparar o tampão de desnaturação e tampão de extração.
Nota: Para maximizar o rendimento de DNA, é fundamental para fazer precisamente buffers seguir as instruções.

3. Colocar 2 g de solo em uma argamassa pré-refrigeradas.
Nota: O solo coletados em campo devem ser congeladas em gelo seco para o transporte e armazenadas a -80 ° C. Descongelar e solo peneira com uma peneira de 2 mm antes da extração do DNA. Você pode aumentar o montante inicial do solo até 10 g.

4. Adicionar 1 ml de solução de desnaturação ao solo.

5. Congelamento e moer o solo em N ₂ líquido usando um pilão até que as partículas do solo olhar em pó e homogênea. Repita congelamento e trituração duas vezes.
Nota: Mantenha a amostra de solo congelado durante a moagem, utilizando nitrogênio líquido suficiente para cobrir totalmente a amostra de solo. Derretendo ligeira durante a moagem é aceitável.

6. Transferir o solo de terra para um tubo de 50 ml com uma espátula de pré-refrigerados.
Nota: A amostra de solo solo podem ser armazenadas a -80 ° C neste momento, se necessário.

7. Adicionar 9 ml de tampão de extração. Para misturar a solução e no solo, brevemente vortex em baixa velocidade.
Nota: Para garantir o buffer é homogênea, aquecê-lo a 60 ° C por 10-15 minutos antes de usar. Manter o resto de tampão a 60 ° C em toda a extração. Vortex em velocidade 8 (numa escala onde 10 é o máximo).

8. Incubar por 40 min a 65 ° C em um forno de hibridização. Durante a incubação, os tubos de girar continuamente na velocidade mais baixa, ou inverter cuidadosamente os tubos a cada 10 minutos.
Nota: Coloque o tubo horizontalmente em um forno de hibridização para permitir buffer de entrar em contato com o solo sobre uma grande superfície. A solução pode parecer um pouco viscoso durante a incubação.

9. Centrifugar a 1800 x g, por 10 min a 10-14 ° C. Transfira o sobrenadante para a pré-refrigerados tubo de 50 ml contendo 20 ml de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1), manter no gelo.
Nota: Quando você transferir o sobrenadante, tome cuidado para não perturbar a camada orgânica (camada inferior). Deixe 1-2 ml de sobrenadante, se for necessário, a fim de coletar somente o sobrenadante limpo. Muitas vezes você pode ver uma camada de bege (mm aproximadamente 1-3 de espessura) em cima do sobrenadante. Não perturbe essa camada ao coletar o sobrenadante. Tente deslizar a ponta ao longo da parede do tubo para impedir a ruptura desta camada bege. Se o sobrenadante é muito turvo, repetir a extração de álcool clorofórmio-isoamílico mais uma vez no sobrenadante. Não use pipetas plásticas descartáveis ​​ao transferir clorofórmio, como clorofórmio irá derreter o plástico. Use uma pipeta de vidro, ou um copo cilindro graduado, ou derramar clorofórmio diretamente em tubos cônicos de 50 ml.

10. Extraia o pelotas do solo mais 2 vezes;

10.1. Adicionar 5 ml tampão de extração para as pelotas do solo, misture delicadamente com 1 ml ponta seguido por vórtex breve em baixa velocidade.
Nota: Agite e misture o buffer antes de usar.

10.2. Incubar a 65 ° C por 10 min em forno de hibridização. Centrifugar a 1800 x g, por 10 min a 10-14 ° C.
Transfira o sobrenadante para o tubo no passo 9. Manter o tubo com sobrenadante coletado e clorofórmio-álcool isoamílico em gelo durante a extração.
Nota: Certifique-se de adicionar o sobrenadante para o tubo mesmo sem cruzar a mistura entre as amostras.

10.3. Repita 9.1 e 9.2 mais uma vez.

11. Usando uma placa rotativa, muito suavemente balance o tubo que contém o sobrenadante (14-19 ml) e clorofórmio-álcool isoamílico em 1,25 rpm por 10 min.
Nota: Feche a tampa com muito rigor para evitar fugas. Coloque uma toalha de papel sobre a placa de balanço antes de colocar o tubo de modo que qualquer vazamento pode ser facilmente detectado.

12. Centrifugar a 1800 x g, por 20 min a 10-14 ° C.

13. Transferência de fase aquosa para um novo tubo.
Nota: Não perturbar a interfase entre a fase aquosa (camada superior) e camada orgânica (inferiorcamada) quando você transferir o sobrenadante. Deixe aproximadamente 1,5-2 ml sobrenadante para garantir a coleta de apenas sobrenadante limpo.

14. Recuperar o DNA usando álcool isopropílico (15.a etapa - 21.a). Alternativamente, use Amicon ® Ultra-15 Centrífuga Dispositivos Filter (passo 15.b - 21.b) se você esperar muito baixa quantidade de biomassa em sua amostra, que irá produzir pellet dificilmente visível por isopropílico precipitação de álcool que é difícil de recuperar.

15.a. Coloque o sobrenadante para um tubo de ultracentrífuga novo.

16.a. Adicionar álcool isopropílico para o sobrenadante coletado em uma relação de volume de 0.6:1. Inverter os tubos suavemente algumas vezes para misturar.

17.a Incubar durante 30 min à temperatura ambiente.

18.a. Centrifugar a 16.000 x g, por 20 min a 20-25 ° C. Garantir os pesos de todos os tubos são equilibradas bem antes da etapa de centrifugação.
Nota: Mark a direção da força centrífuga sobre o tubo, para que você possa detectar o pellet de DNA com mais facilidade quando o rendimento de DNA é baixa.

19.a. Remover álcool isopropílico por decantação ou aspiração a vácuo. Tenha cuidado para não perturbar o pellet de DNA.
Nota: Remover álcool isopropílico, logo que a centrifugação seja concluída. Tenha muito cuidado para não perder o pellet de DNA. O tamanho do pellet de DNA pode variar muito, dependendo do tipo de solo, a partir de uma bem visível (~ 9 mm de diâmetro) para apenas visível. É recomendado para remover os resíduos de álcool isopropílico por aspiração ao longo da parede do tubo com cuidado para não sugar o pellet de DNA.

20.a. Seca DNA pellet em temperatura ambiente por 5-20 min.
Nota: Não mais seco pellet de DNA, caso contrário, será difícil para dissolver o DNA.

21.A. Ressuspender o sedimento de DNA em 200 mL de TE. Misturá-lo tocando suave. Transferir a solução de DNA em tubo de 1,5 ml. Manter o tubo a 4 ° C durante a noite, a fim de dissolver completamente DNA.
Nota: Dependendo do tamanho do pellet, você pode ajustar o volume de TE para adicionar. Geralmente 200-400 mL de TE funciona bem.

* Como alternativa, siga os passos 15.b - 21.b.

15.b. Uma pré-lavagem Amicon ® Ultra-15 Centrífuga dispositivos de filtro, adicione 15 ml TE para o dispositivo e centrifugar a 3500 x g, por 10 min. Descartar o escoamento.

16.b. Coloque a solução de DNA a partir do passo 13 para o filtro Amicon pré-lavados. Centrifugar a 3500 x g até que o volume de DNA é reduzida a 200-500 mL. Descartar o escoamento.

17.b. Lavar o DNA com TE duas vezes; adicionar 10 ml TE aos dispositivos Amicon filtro. Centrifugar a 3500 x g até que o volume de DNA é reduzida a cerca de 200 mL. Descartar o escoamento. Repita mais uma vez.

18-B Transferir a solução de DNA no filtro para um tubo ml novo 1.5.

19.b. Adicionar 40 mL de TE o filtro Amicon. Lavar ambos os lados da membrana do filtro por pipetagem cima e para baixo a fim de recuperar qualquer resíduo de DNA no filtro. Adicionar esta solução de lavagem para o tubo de 18-B passo

20.b. Se necessário, o DNA pode ser ainda mais concentrada por microcontrolador Ultracel YM-30 ® Unidade Centrífuga Filter; pré-lavagem do filtro, adicionando 200 mL de TE e centrifugação a 10.000 x g por 7 minutos. Adicionar a solução de DNA para o filtro e centrifugar a 5000 x g por 1 min. Repetir a centrifugação até que a quantidade de solução de DNA no filtro reduzido a cerca de 50 ul.
Nota: Máximo volume da amostra inicial para microcontrolador filtro é de 500 mL. Não centrifugue a velocidades superiores a 14.000 x g. Não mais de centrífuga até a membrana seca completamente. Garantir que algum líquido ainda cobre o filtro após a centrifugação. Se mais de centrifugado e da membrana está seca, em seguida, adicione 15 mL TE, agitar suavemente durante 30 segundos e avance para o passo 21.b.

21.b. Coloque a unidade de filtro de cabeça para baixo em um tubo novo microcontrolador e centrifugar a 1000 xg por 3 min para recuperar o DNA.

22. Quantificar DNA por TAE gel (0,8%, 0.5xTAE, 50 V por 4 horas), e por espectrofotômetro Nanodrop ou Pico-verde ensaio e leitor de placas.
Nota: quantidade de DNA pode ser estimado através da comparação da faixa de amostra para a banda marcador com concentração conhecida (marcador molecular de DNA de alta ou λHindIII) sobre o gel.

23. Verificar a integridade do DNA de alto peso molecular por eletroforese em gel em campo pulsado (PFGE) com 1%, 1xTAE gel (Para mais detalhes veja o Passo II, part2 em http://www.jove.com/index/details.stp?id = 1387 , doi: 10.3791/1387 por Taupp et al 2009)..
Nota: Você pode usar gel agarose regulares para essa finalidade QC, em vez de baixa temperatura de fusão agarose. Em resumo, as condições de eletroforese são as seguintes: 02/0250 kb, 6 volts, tempo de comutação inicial: 5 segundos, tempo final de comutação: 15 seg, executado por 12 horas a 14 ° C. Ouro SYBR coloração de uma hora para visualizar o DNA do gel.

24. Se os pesos moleculares de DNA extraídos são satisfatórios, em seguida, avance para a etapa de centrifugação de gradiente de CsCl seguinte. Alternativamente, o DNA pode ser armazenado a -20 ° C ou -80 ° C antes da centrifugação CsCl.
A mediana do tamanho do DNA deve ser igual ou superior a 36 Kb, se você quiser construir uma grande biblioteca de inserir DNA metagenomic.

Parte II. Purificação de DNA usando cloreto de césio ultracentrifugação de gradiente

Preparação de centrifugação: 1,5 - 2 horas
Etapa de centrifugação: 18 horas
Removendo brometo de etídio (EtBr) e concentrando o ADN após a centrifugação: 3 horas

Procedimento

Para detalhes, consulte Wright et al. . 2009 http://www.jove.com/index/details.stp?id=1352 , doi: 10.3791/1352

Resultados representante / Resultado

A quantidade total de DNA genômico isolado de 2 g de floresta orgânica do solo (horizonte O) e horizontes minerais (Ae, AB, Bt e horizontes) (amostragem da produtividade do solo de Longo Prazo (LTSP) site localizado na Skulow lago, BC, Canadá e gerido pela BC Ministério de Florestas e Range) variou de 10 mg a 180 mg. O tamanho médio de DNA isolado foi geralmente entre 40-60 kb (Figura 1). A relação de absorvância a 260 nm foi nm/280 entre 1,3-1,6 e houve um pico em 230 nm, o que pode indicar a contaminação ácidos húmicos freqüentemente observada em amostras de solo. A centrifugação em gradiente de CsCl reduziu drasticamente essa contaminação e também aumentou a proporção de 260/280 para 1,8-1,9, como mostrado na Figura 2a e 2b.

Imagens figura 1. PFGE do DNA genômico extraído antes ultracentrifugação CsCl. lane1: 1 kb marcador 100 ng, pista 2: λHind III marcador 100 ng, pista 3: λHind III marcador 250 ng, pista 4: λHind III marcador 500 ng, lane5: Fosmid 36 kb marcador 100 ng, pista 6 e 7: genômica DNA isolado do solo de horizonte mineral Ae, pista 8 e 9: o DNA genômico isolado do horizonte AB mineral do solo no local LTSP localizado Skulow lago, BC

Figura 2. Chromograms do DNA genômico detectada pelo espectrofotômetro antes (A) e depois de CsCl ultracentrifugação (B). Observe a redução do valor de absorbância no comprimento de onda nm após 230 CsCl ultracentrifugação, o que indica melhoria na qualidade do DNA genômico. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 2.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
*Denaturing solution: 10 ml in total
Guanidine isothiocyanate (MW 118.16), 4.73 g
1M Tris-HCl (pH 7.0), 100 μl
0.5M EDTA, 20 μl
Add water to 9.95 ml in total.
Autoclave.
Add 50 μl 2-mercapt–thanol just before use. (5 μl of 2-mercapt–thanol per 1 ml Denaturing Solution)
Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C. Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use.
**Extraction Buffer
1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*, 100 ml
1M Tris-HCl [pH 7.0], 100 ml
0.5M EDTA [pH 8.0], 200 ml
5 M NaCl, 300 ml
Autoclave and keep it at room temperature.
Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C.
* 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0
Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended.