Summary
我们提出了有针对性的古DNA序列检索，这是我们用来重建完整的线粒体基因组的5个尼安德特人的个人方法。现今人类的这些序列的比较表明，尼安德特人有一个长期的低有效的人口规模。
Abstract
我们提出了有针对性的DNA DNA的来源，其中严重退化和污染的微生物DNA序列检索的方法，是典型的古代骨骼。该方法大大降低了样品的破坏和测序的要求相对于直接PCR或鸟枪测序方法。我们用这种方法来重建完整的线粒体DNA（mtDNA）的五个尼安德特人的基因组，来自全国各地其地理范围。后期尼安德特人线粒体DNA的遗传多样性比当代现代人类的大约三倍。连同线粒体蛋白质进化分析，这些数据表明，尼安德特人的长期有效的人口规模小于现代人类和现存的类人猿。
Protocol
使用这种方法是，在研究中报道的百等。，325（5938）科学 。 318-321（2009） 。
试剂要求：
- AmpliTaq黄金DNA聚合酶
- 10X GeneAmp PCR缓冲液II
- MgCl 2的 25MM
- dNTP混合液，每25毫米
- BSA，10毫克毫升水1
- 分子生物学级水
- EB缓冲液（用MinElute PCR纯化试剂盒提供），10毫米的Tris盐酸，pH值8.5
- MinElute PCR纯化试剂盒
- M - 270链霉亲和素磁珠
- 2个绑定和清洗（BW）缓冲液（2 M氯化钠，10毫米，1毫米EDTA，pH值8.0，0.2％吐温20的Tris - CL）
- 1X绑定和清洗（BW）缓冲液（2X BindWash缓冲液稀释水2X）
- 热洗（硬件）缓冲液（1X的Taq黄金缓冲区，2.5mm的氯化镁，0.1％吐温20）
关于非标准试剂和仪器的制造商信息，请参见后表。
1）图书馆放大
- 这里的DNA为模板，是一个从低拷贝数的DNA中所述的源（Rohland和Hofreiter，2007年，2007年b）和（Maricic和帕博，2009年）编写的454库。要健全整个库，准备下面的PCR混合物：
试剂 μL，每个反应 水 45 10X基因AMP PCR缓冲液II 10 氯化镁2（25MM） 10 BSA（10毫克/毫升） 2 dNTPs（各25毫米） 1 454 emPCR FWD primer/10uM 3 454 emPCR RVS primer/10uM 3 AmpliTaq黄金DNA聚合酶（5 U /μL） 1 454 DNA库模板 25 共有 100 - 使用以下的PCR 程序，14个循环扩增热循环仪
- 95 °彗星12分钟
- 95 °彗星30秒
- 60 ° C（或所需的退火温度）1分钟
- 72℃1分钟
- 2（× 13）
- 72 °彗星5分钟
- 10 °彗星∞
- 净化根据制造商的指示超过Qiagen公司MinElute离心柱的反应。洗脱50μL缓冲液EB。
- 量化纯化扩增产物以及定量PCR（Meyer等人，2007年）的非放大库等分。如果扩增产物已超过1 × 10 12份，每UL，减少在下面的引物延伸的模板量，以确保不超过2 × 10 12副本添加到引物延伸反应。
2）引物延伸
- 准备一个反应所需数量的主结构。
试剂 μL，每个反应 水 45 10X基因AMP PCR缓冲液II 10 氯化镁2（25MM） 10 BSA（10毫克/毫升） 2 dNTPs（各25毫米） 1 454 emPCR FWD primer/10uM 3 454 emPCR RVS primer/10uM 3 AmpliTaq黄金DNA聚合酶（5 U /μL） 1 454 DNA库模板 25 共有 100 - 单引物延伸反应的热循环运行以下程序：
- 95 °彗星12分钟
- 60 ° C（或您的PEC的引物退火温度不同）1分钟
- 72℃5分钟
- 72 °彗星永远！
关键的一步延伸反应后保持在72 ° C 。然后直接移液器150ul的PBI或PB缓冲液从加热块中取出之前QIAGEN公司MinElute管道进入净化。这一点很重要，以避免非特异性引物退火和捕获的混合物冷却。
- 净化超过Qiagen公司MinElute离心柱的反应，根据制造商的指示。在50μL的EB洗脱。
3）延伸产品捕捉
- 悬浮原液的M - 270珠震荡。取出25μL珠每个样品悬挂。珠两次洗500ul 2X BW缓冲和重悬在每个样品25μL2xBW缓冲区。
- 从步骤2.3中添加25μL洗脱液25μL 步骤 3.1珠悬挂。然后旋转混合1在室温下5分钟。
建议 ：保持其余的步骤定量PCR定量2.3 5洗脱液UL。 - 整个混合物转移到一个新的1.5毫升管（这有助于减少非目标库片段结转）。颗粒的上清液用磁性粒子收集器（MPC），弃上清。
- 洗净用500μl1xBW缓冲区（许多清洗有助于消除尽可能多的背景）的5倍。在最后的洗涤步骤，降速简要上清液中删除的痕迹。
- 加入500μL1X热洗（硬件）缓冲区。摇2分钟，在65 ° C（或以上PEC底漆TM 5C）在热块。快速去除上清，在此之后，，以尽量减少降温。 （这一步是删除仍然PEC的引物，但实际上并不在延伸扩展的背景片段）。除去上清的最后的痕迹。
- 在30μL的EB缓冲液重悬磁珠颗粒。整个混合物转移到一个新的1.5毫升管（这有助于减少非目标库片段结转）。在95℃孵育3分钟，在热循环仪进行洗脱。放置在MPC和去除上清，照顾身后留下的珠。
4）Capture产品放大
- 准备一个样品所需数量的PCR扩增预混。
试剂 μL，每个反应 水 45 10X基因AMP PCR缓冲液II 10 氯化镁2（25MM） 10 BSA（10毫克/毫升） 2 dNTPs（各25毫米） 1 454 emPCR FWD primer/10uM 3 454 emPCR RVS primer/10uM 3 AmpliTaq黄金DNA聚合酶（5 U /μL） 1 洗脱捕捉产品 25 共有 100 - 在14个循环扩增热循环仪使用以下的PCR程序：
- 95 °彗星12分钟
- 95 °彗星30秒
- 60 ° C（或所需的退火温度）1分钟
- 72℃1分钟
- 2（× 13）
- 72 °彗星5分钟
- 10 °彗星∞
- 超过Qiagen公司MinElute硅离心柱净化，根据制造商的指示反应。在50μL的EB缓冲液洗脱。该产品可现在使用的捕捉第二轮，开始在步骤2.1中，或直接进入454乳液PCR协议，进行测序。
代表性的成果：
强烈建议时与PEC协议开始执行第一个捕获反应与建议正常少量的阳性对照目标序列“（例如〜100bp的PCR产物 - 1皮克很容易不够）混合金额扩增454库模板（见第2.1步），并捕获与一个单一的PEC捕捉到的阳性对照产品设计引物进行。如果执行这种控制的反应是，qPCR的，既有积极的控制和454适配器特异性引物对可用于量化“控制目标”的量与纯化的引物延伸反应（1.3），引物延伸产品（ 2.3的背景）和洗脱磁珠捕获产品（3.6）。这样，无论是背景去除（“特殊性”），并在您的实验条件下的效率目标恢复（“敏感性”）的成效，可以直接测量。
一个成功的PEC协议通常具有以下属性 -
灵敏度（保留通过协议控制目标量测）：
的洗脱磁珠捕获产品的总量控制目标（3.6）=〜总额的 1-20％，在纯化的引物延伸反应（2.3）。
背景 （454 emPCR引物测）：
（3.6）洗脱磁珠捕获产品总额的背景<纯化的引物延伸反应（2.3）总额的 0.01 ％。
如果有小于1％的最终产品的剩余目标，引物延伸步骤可能已不成功，并且要追究。
如果有比0.01％的背景留在最终产品，洗涤步骤可能已被错误地执行，并应进行调查。
Discussion
佩奇方法简单，快速，敏感性和特异性。因此，我们设想的作者的多个应用程序古代DNA外，如捕获的小分子RNA的RNA库的片段，审讯在样本或捕获16S（或其他位点）的多样性从宏基因组样品的结构变化。有一点要提的是，捕获灵敏度的PEC引物的多重捕获反应增加。因此，PEC是不是非常适合非常大（例如megabase或以上）的捕捉区域捕捉，但捕捉小目标的地区，许多人在快速时尚甚至SNP的立场是非常适合。
Acknowledgments
我们感谢M.迈尔的意见;克罗地亚科学和艺术学院和柏林 - 勃兰登堡科学院后勤和科学支持科学和马普学会主席创新基金的财政支持。 JMG是支持由美国国家科学基金会国际博士后奖学金（OISE - 0754461）。序列是存放在EBI的核苷酸数据库加入数字：1（Feldhofer 1）穴居人FM865407，尼安德特人2（Feldhofer 2）FM865408，Sidron 1253 FM865409，Vindija 33.25 FM865410，Mezmaiskaya 1 FM865411
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AmpliTaq Gold polymerase with GeneAmp PCR buffer II and MgCl2 | Applied Biosystems | N8080241 | |
| QIAGEN MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| M-270 streptavidin beads | Invitrogen | 653.05 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| DynaMag-2 magnetic particle separator | Invitrogen | 120.02D |
References
- Briggs, A. W., Good, J. M., Green, R. E., Krause, J., Maricic, T., Stenzel, U., Lalueza-Fox, C., Rudan, P., Brajkovic, D., Kucan, Z. Targeted retrieval and analysis of five Neandertal mtDNA genomes. Science. 325 (5938), 318-321 (2009).
- Rohland, N., Hofreiter, M. Comparison and optimization of ancient DNA extraction. Biotechniques. 42 (3), 343-352 (2007).
- Rohland, N., Hofreiter, M. Ancient DNA extraction from bones and teeth. Nat Protoc. 2 (7), 1756-1762 (2007).
- Maricic, T., Pääbo, S. Optimization of 454 sequencing library preparation from small amounts of DNA permits sequence determination of both DNA strands. Biotechniques. 46 (1), 51-57 (2009).
- Meyer, M., AW, B. riggs, Maricic, T., Hober, B., Hoffner, B., Krause, J., Weihmann, A., Paabo, S., Hofreiter, M. From micrograms to picograms: quantitative PCR reduces the material demands of high-throughput sequencing. Nucleic Acids Res. 36 (1), e5-e5 (2007).
