Summary
Мы представляем метод целевого поиска древних последовательности ДНК, которые мы использовали для восстановления полного митохондриального генома неандертальца из пяти лиц. Сравнение этих последовательностей с настоящим людям день позволяет предположить, что неандертальцы были долгосрочные низкой эффективной численностью населения.
Abstract
Мы представляем метод целевого поиска последовательностей ДНК из ДНК источников, которые сильно деградированных и загрязненных микробной ДНК, как это характерно для древних костей. Метод значительно уменьшает разрушение образца и последовательности требования относительно прямой ПЦР или подходы дробовик секвенирования. Мы использовали этот метод для восстановления полной митохондриальной ДНК (мтДНК) геномов пяти неандертальцев из разных географические пределы их распространения. МтДНК генетическое разнообразие неандертальцев поздно было примерно в три раза ниже, чем у современных современных людей. Вместе с анализом эволюции белка мтДНК, эти данные свидетельствуют о том, что долгосрочный эффективный размер популяции неандертальцев было меньше, чем у современного человека и существующих приматов.
Protocol
Этот метод был использован в исследованиях сообщается в Бриггс и соавт., Наука 325 (5938). 318-321 (2009) .
Реагенты требуется:
- AmpliTaq Золотой ДНК-полимераза
- 10x GeneAmp ПЦР буфера II
- MgCl 2 25 мМ
- дНТФ микс, 25 мМ каждого
- БСА, 10 мг-1 мл в воде
- Молекулярная биология класса воды
- Е. Б. буфера (поставляется вместе с комплектом MinElute очистки ПЦР); 10 мМ Трис-HCl, рН 8,5
- MinElute ПЦР Очистка Kit
- М-270 стрептавидин Dynabeads
- 2x Связывание и промыть (BW) буфера (2 М NaCl, 10 мМ Трис-Cl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0, 0,2% Твин 20)
- 1x Связывание и промыть (BW) буфер (2x BindWash буфера 2X разбавленный в воде)
- Горячая промывка (HW) буфер (2,5 мм MgCl, 1X Taq Золото буфера, 0,1% Твин 20)
Для производителя информацию о нестандартных реактивов и оборудования см. ниже таблицу.
1) Библиотека усиления
- ДНК-матрицы здесь 454 библиотеки получают из низкого числа копий ДНК источник, как описано в (Роланд и Hofreiter, 2007a, 2007b) и (Maricic и Pääbo, 2009). Для усиления целую библиотеку, подготовить следующие смеси ПЦР:
Реагент мкл на реакцию Воды 45 10X Гена Amp PCR буфера II 10 MgCl 2 (25 мм) 10 BSA (10 мг / мл) 2 дНТФ (25 мМ каждого) 1 454 emPCR FWD primer/10uM 3 454 emPCR РВС primer/10uM 3 AmpliTaq Золотой ДНК-полимераза (5 ед / мкл) 1 454 ДНК библиотеку шаблонов 25 Общий 100 - Используйте следующую программу ПЦР в Thermo циклер в течение 14 циклов усиления
- 95 ° С 12 мин
- 95 ° C 30-х годов
- 60 ° C (или желаемого отжига температура) 1 мин
- 72 ° С 1 мин
- К 2 (х 13)
- 72 ° С 5 минут
- 10 ° C ∞
- Purify реакции на спину Qiagen MinElute колонки в соответствии с инструкциями производителя. Элюции в 50 мкл EB буфера.
- Количественная очищенной усиливается продукта, а также аликвоту неусиленных библиотека с КПЦР (Meyer и соавт., 2007). Если усиленный продукт имеет более чем 1 X 10 12 копий в мкл, уменьшить количество шаблонов на следующем этапе удлинения праймера, чтобы не более 2 х 10 12 копий добавляются реакции удлинения праймера.
2) удлинения праймера
- Подготовка мастер микс для необходимого количества реакций.
Реагент мкл на реакцию Воды 45 10X Гена Amp PCR буфера II 10 MgCl 2 (25 мм) 10 BSA (10 мг / мл) 2 дНТФ (25 мМ каждого) 1 454 emPCR FWD primer/10uM 3 454 emPCR РВС primer/10uM 3 AmpliTaq Золотой ДНК-полимераза (5 ед / мкл) 1 454 ДНК библиотеку шаблонов 25 Общий 100 - Выполните следующую программу в Термоциклер для одной реакции удлинения праймера:
- 95 ° С 12 мин
- 60 ° C (или ваш УИК грунтовки температура отжига если отличается) 1 мин
- 72 ° C 5 мин
- 72 ° C навсегда!
Важнейший шаг Держите реакции после расширения при 72 ° C. Затем непосредственно пипеткой 150ul PBI или PB буфер для QIAGEN MinElute очистки в трубы перед снятием с огня блока. Это очень важно, чтобы избежать неспецифических праймеров отжига и захватить как смесь остынет.
- Purify реакции на спину колонке Qiagen MinElute, в соответствии с инструкциями производителя. Элюции в 50 мкл EB.
3) расширение продукта Capture
- Ресуспендируют исходного раствора М-270 бусин на вортексе. Выньте 25 мкл суспензии в шарик образца. Вымойте бисером дважды 500ul 2x BW буфера и ресуспендируют в 25 мкл буфера 2xBW на образец.
- Добавить 25 мкл элюата с шага от 2,3 до 25 мкл бусинка подвески с шага 3.1. Смешать затем поверните на 15 мин при комнатной температуре.
Рекомендуемые: сохранить оставшиеся 5 мкл элюата с шага 2.3 для количественного КПЦР. - Передача всей смеси по 1,5 мл свежей трубки (это помогает уменьшить унос нецелевых фрагментов библиотеки). Гранул супернатант использованием магнитных частиц коллектор (ПДК) и отбросить супернатант.
- Промыть 5 раз с 500 мкл буфера 1xBW (многие моет помочь удалить как можно больше фона, как это возможно). После последней промывки, спин вниз кратко и удалить последние следы супернатант.
- Добавить 500 мкл 1x Горячая промывка (HW) буфера. Встряхните в течение 2 мин при 65 ° С (или выше 5C УИК грунтовки Tm) на тепловых блоков. Удалить супернатант быстро после этого, чтобы свести к минимуму охлаждение. (Этот шаг заключается в удалении фона фрагменты сих пор ассоциируется с УИК грунтовки, но фактически не продлен во время расширения шаг). Удалить последние следы супернатант.
- Ресуспендируют бусинка гранул в 30 мкл буфера EB. Передача всей смеси по 1,5 мл свежей трубки (это помогает уменьшить унос нецелевых фрагментов библиотеки). Инкубировать при 95 ° С в течение 3 минут в термоциклер для элюирования. Место в MPC и удалить супернатант, заботясь, чтобы оставить позади бисером.
4) Захват продуктов амплификации
- Подготовка смеси ПЦР-мастера для необходимого количества образцов.
Реагент мкл на реакцию Воды 45 10X Гена Amp PCR буфера II 10 MgCl 2 (25 мм) 10 BSA (10 мг / мл) 2 дНТФ (25 мМ каждого) 1 454 emPCR FWD primer/10uM 3 454 emPCR РВС primer/10uM 3 AmpliTaq Золотой ДНК-полимераза (5 ед / мкл) 1 Элюировали продукта захвата 25 Общий 100 - Используйте следующую программу ПЦР в Thermo циклер для усиления 14 циклов:
- 95 ° С 12 мин
- 95 ° C 30-х годов
- 60 ° C (или желаемого отжига температура) 1 мин
- 72 ° С 1 мин
- К 2 (х 13)
- 72 ° С 5 минут
- 10 ° C ∞
- Purify реакции на кремний Qiagen колонке спина MinElute в соответствии с инструкциями производителя. Элюции в 50 мкл буфера EB. Продукт можно теперь использовать как для второго тура захвата, начиная с шага 2.1, или вводятся непосредственно в 454 эмульсии ПЦР протокол, для секвенирования.
Представитель Результаты:
Настоятельно рекомендуется, когда начинали с УИК протокола для выполнения первой реакции захвата, где небольшое количество "положительной последовательности целевого управления» (например, ~ 100bp ПЦР-продукта - 1 пикограмм достаточно легко) смешивается с нормальным рекомендуется Сумма усиленного 454 библиотека шаблонов (см. шаг 2.1), и захват осуществляется с одного праймера УИК предназначены для улавливания положительного контроля продукции. Если этот контроль осуществляется реакция, КПЦР как с положительным контролем конкретных и 454 адаптер конкретной пары праймеров может быть использована для определения количества «контроль целевого" по сравнению с фоном в очищенной реакции удлинения праймера (1,3), продукт удлинения праймера (2,3 ) и элюировали бусинка продукта захвата (3,6). Таким образом, как эффективность удаление фона ("специфичность") и эффективности целевых восстановления ("чувствительность") в экспериментальных условиях могут быть непосредственно измерены.
Успешное УИК протокола обычно имеет следующие свойства -
Чувствительность (измеряется количество контроля целевого сохранил через протокол):
Общая сумма целевого элемента управления в элюировали бусинка продукта захвата (3,6) = ~ 1-20% от общей суммы в очищенной удлинения праймера реакции (2,3).
Фон (измеряется 454 пары праймеров emPCR):
Общая сумма фон в элюировали бусинка продукта захвата (3,6) <0,01% от общей суммы в очищенной реакции удлинения праймера (2,3).
Если есть менее 1% от целевого показателя, оставшихся в конечном продукте, шаг удлинения праймера, возможно, был неудачным, и должны быть расследованы.
Если есть гораздо больше, чем 0,01% от фона, оставшихся в готовой продукции, промывки, возможно, были неправильно выполнены и должны быть расследованы.
Discussion
Метод УИК является простым, быстрым, чувствительным и специфичным. Поэтому авторы предусматривают несколько приложений за пределами древней ДНК, такие, как захват небольших фрагментов РНК из библиотеки РНК, допрос структурные изменения в совокупной выборки или захват 16S (или других локусов) разнообразия от метагеномных образца. Одна точка говоря уже о том, что чувствительность захвата становится меньше, так как количество УИК праймеров в мультиплексе увеличивает захват реакции. УИК, следовательно, не идеально подходит для захвата очень велика (например, megabase или более) областей захвата, но очень хорошо подходит для захвата небольших целевых регионах или даже SNP позиции от многих людей в быстром моды.
Acknowledgments
Мы благодарим М. Мейер за советом, Хорватская академия наук и искусств и Берлин-Бранденбург академии наук за материально-техническую и научную поддержку, а также фонда Президента Республики Беларусь Инновация Общества Макса Планка за финансовую поддержку. JMG была поддержана NSF международной докторской стипендий (OISE-0754461). Последовательности сданы на хранение в EBI нуклеотидных баз данных с регистрационные номера: неандертальцев 1 (Feldhofer 1) FM865407, неандертальцев 2 (Feldhofer 2) FM865408, Sidron 1253 FM865409, Vindija 33,25 FM865410, Mezmaiskaya 1 FM865411
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AmpliTaq Gold polymerase with GeneAmp PCR buffer II and MgCl2 | Applied Biosystems | N8080241 | |
| QIAGEN MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| M-270 streptavidin beads | Invitrogen | 653.05 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| DynaMag-2 magnetic particle separator | Invitrogen | 120.02D |
References
- Briggs, A. W., Good, J. M., Green, R. E., Krause, J., Maricic, T., Stenzel, U., Lalueza-Fox, C., Rudan, P., Brajkovic, D., Kucan, Z. Targeted retrieval and analysis of five Neandertal mtDNA genomes. Science. 325 (5938), 318-321 (2009).
- Rohland, N., Hofreiter, M. Comparison and optimization of ancient DNA extraction. Biotechniques. 42 (3), 343-352 (2007).
- Rohland, N., Hofreiter, M. Ancient DNA extraction from bones and teeth. Nat Protoc. 2 (7), 1756-1762 (2007).
- Maricic, T., Pääbo, S. Optimization of 454 sequencing library preparation from small amounts of DNA permits sequence determination of both DNA strands. Biotechniques. 46 (1), 51-57 (2009).
- Meyer, M., AW, B. riggs, Maricic, T., Hober, B., Hoffner, B., Krause, J., Weihmann, A., Paabo, S., Hofreiter, M. From micrograms to picograms: quantitative PCR reduces the material demands of high-throughput sequencing. Nucleic Acids Res. 36 (1), e5-e5 (2007).
