Summary
Vi presenterar en metod för målinriktad forntida DNA-sekvens hämtning, som vi använde för att rekonstruera den kompletta mitokondriella kartläggningen av fem Neandertal individer. Jämförelse av dessa sekvenser med dagens människor tyder på att Neandertalare hade en långsiktigt låg effektiv populationsstorlek.
Abstract
Vi presenterar en metod för målinriktad DNA-sekvens hämtning från DNA-källor som är kraftigt försämrats och förorenats med mikrobiella DNA, som är typiskt för gamla ben. Metoden minskar kraftigt prov förstörelse och krav sekvensering i relation till direkt PCR eller hagelgevär närmar sekvensering. Vi använde denna metod för att rekonstruera den kompletta mitokondrie-DNA (mtDNA) kartläggningen av fem Neandertalare från hela deras geografiska område. MtDNA genetiska mångfalden i slutet av Neandertalare var ca tre gånger lägre än för dagens moderna människor. Tillsammans med analyser av mtDNA protein evolutionen, antyder dessa data att den långsiktiga effektiv populationsstorlek på Neandertalare var mindre än för moderna människor och bevarade människoapor.
Protocol
Denna metod användes i forskningen redovisas i Briggs et al. Science 325 (5938). 318-321 (2009) .
Reagenser som krävs:
- AmpliTaq Gold DNA-polymeras
- 10x GeneAmp PCR buffert II
- MgCl 2 25MM
- dNTP mix, 25 mm vardera
- BSA, 10 mg ml-1 i vatten
- Molekylärbiologi-grade vatten
- EB buffert (levereras med MinElute PCR Purification Kit), 10 mM Tris HCl, pH 8,5
- MinElute PCR Purification Kit
- M-270 streptavidin Dynabeads
- 2x Bindning och Wash (BW) buffert (2 M NaCl, 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,2% Tween 20)
- 1x Bindning och Wash (BW) buffert (2x BindWash buffert utspädd 2X i vatten)
- Hot Wash (HW) buffert (2,5 MgCl, 1x Taq Guld buffert, 0,1% Tween 20)
För tillverkaren information om icke-standardiserade reagens och utrustning se senare bord.
1) Bibliotek förstärkning
- Den DNA-mall här är en 454 bibliotek beretts av ett lågt antal exemplar DNA-källa som beskrivs i (Rohland och Hofreiter, 2007a, 2007b) och (Maricic och Pääbo, 2009). Att förstärka hela biblioteket, förbereda följande PCR-mix:
Reagens l per reaktion Vatten 45 10X Gene Amp PCR-buffert II 10 MgCl 2 (25mm) 10 BSA (10 mg / ml) 2 dNTPs (25 mm vardera) 1 454 emPCR framåt primer/10uM 3 454 emPCR husvagnar primer/10uM 3 AmpliTaq Gold DNA-polymeras (5 U / l) 1 454 DNA-bibliotek mall 25 Totalt 100 - Använd följande PCR-program i en Thermo apparat för 14 cykler förstärkning
- 95 ° C 12min
- 95 ° C 30-talet
- 60 ° C (eller önskad annealing temp) 1 min
- 72 ° C 1 min
- Gå till 2 (x 13)
- 72 ° C 5min
- 10 ° C ∞
- Rena reaktionen över en Qiagen MinElute snurra kolumnen enligt tillverkarens anvisningar. Eluera i 50 l buffert EB.
- Kvantifiera renade förstärkta produkten samt en delmängd av oförstärkta bibliotek med qPCR (Meyer et al., 2007). Om det förstärkta produkten har mer än 1 x 10 12 kopior per ul, minska mängden mallen i följande Primer Extension steg för att säkerställa att inte mer än 2 X 10 12 kopior läggs till Primer Extension reaktion.
2) Primer Extension
- Förbered en master mix för erforderligt antal reaktioner.
Reagens l per reaktion Vatten 45 10X Gene Amp PCR-buffert II 10 MgCl 2 (25mm) 10 BSA (10 mg / ml) 2 dNTPs (25 mm vardera) 1 454 emPCR framåt primer/10uM 3 454 emPCR husvagnar primer/10uM 3 AmpliTaq Gold DNA-polymeras (5 U / l) 1 454 DNA-bibliotek mall 25 Totalt 100 - Kör följande program i en termocykler för den inre primer förlängning reaktion:
- 95 ° C 12min
- 60 ° C (eller din PEC grundfärg glödgning temp om annan) 1 min
- 72 ° C 5 min
- 72 ° C för evigt!
Kritiska steget Håll reaktion efter förlängning vid 72 ° C. Sen direkt pipett 150ul PBI eller PB buffert för QIAGEN MinElute rening i rören innan du tar bort från värmen blocket. Detta är viktigt för att undvika icke-specifik primer glödgning och fånga så blandningen svalnar.
- Rena reaktionen över en Qiagen MinElute spin kolumn, enligt tillverkarens anvisningar. Eluera i 50 l EB.
3) förlängare Capture
- Resuspendera stamlösning av M-270 pärlor genom att vortexa. Ta ut 25 l pärla fjädring per prov. Tvätta pärlor två gånger med 500ul 2x BW buffert och återsuspendera i 25 l 2xBW buffert per prov.
- Tillsätt 25 l eluat från steg från 2,3 till 25 l pärla avstängning från steg 3,1. Blanda sedan rotera under 15 min vid rumstemperatur.
Rekommenderas: att hålla kvar 5 ul av eluatet från steg 2,3 för qPCR kvantifiering. - Överför hela blandningen till ett nytt 1,5 ml rör (detta bidrar till att minska överföring av icke-målorganismer bibliotek fragment). Pellets supernatanten med Magnetpulverprovning kollektorn (MPC) och kassera supernatanten.
- Tvätta 5 gånger med 500 l 1xBW buffert (många tvättar hjälpa till att ta bort så mycket bakgrundsinformation som möjligt). Efter sista tvätt, spinn ner en kort stund och avlägsna de sista spåren av supernatanten.
- Lägg 500μl 1x Hot Wash (HW) buffert. Skaka i 2 minuter vid 65 ° C (eller 5c över PEC primer tm) på en termisk block. Avlägsna supernatanten snabbt efter detta, för att minimera avkylning. (Detta steg är att ta bort bakgrunden fragment fortfarande förknippas med PEC primers, men egentligen inte förlängts under förlängningen steg). Ta bort de sista spåren av supernatanten.
- Resuspendera pärla pelleten i 30 l EB buffert. Överför hela blandningen till ett nytt 1,5 ml rör (detta bidrar till att minska överföring av icke-målorganismer bibliotek fragment). Inkubera vid 95 ° C i 3 minuter i en värmecykeln eluering. Plats i MPC och avlägsna supernatanten noga med att lämna pärlor bakom.
4) Fånga Produkt förstärkning
- Förbered en PCR Master Mix för erforderligt antal prover.
Reagens l per reaktion Vatten 45 10X Gene Amp PCR-buffert II 10 MgCl 2 (25mm) 10 BSA (10 mg / ml) 2 dNTPs (25 mm vardera) 1 454 emPCR framåt primer/10uM 3 454 emPCR husvagnar primer/10uM 3 AmpliTaq Gold DNA-polymeras (5 U / l) 1 Elueras fånga produkt 25 Totalt 100 - Använd följande PCR-program i en Thermo apparat för 14 cykler förstärkning:
- 95 ° C 12min
- 95 ° C 30-talet
- 60 ° C (eller önskad annealing temp) 1 min
- 72 ° C 1 min
- Gå till 2 (x 13)
- 72 ° C 5min
- 10 ° C ∞
- Rena reaktionen över en Qiagen MinElute kvarts spin kolumnen enligt tillverkarens anvisningar. Eluera i 50 l EB buffert. Produkten kan nu användas antingen för en andra omgång av fångar, med början vid steg 2,1, eller anges direkt i 454 emulsionen PCR-protokoll, för sekvensering.
Representativa resultat:
Det rekommenderas starkt när du börjar med PEC-protokollet för att först utföra en capture reaktion där en liten mängd av en "positiv kontroll målsekvens" (t.ex. en ~ 100 bp PCR-produkt - 1 pikogram är enkelt nog) blandas med den rekommenderade normala mängd förstärks 454 bibliotek mall (se steg 2.1), och fånga utförs med en enda PEC primer för att fånga den positiva kontrollen produkten. Om denna kontroll reaktion utförs qPCR med både positiva kontroll-specifika och 454-adapter-specifika par grundfärg kan användas för att kvantifiera mängden "kontroll mål" mot bakgrund i det renade primer förlängning reaktion (1,3), primer-förlängare (2,3 ) och elueras pärla fånga produkt (3,6). På detta sätt kan både effektiviteten i bakgrunden borttagning ("specificitet") och effektivitet i målet återhämtning ("känslighet") i din experimentella förhållanden mätas direkt.
En framgångsrik PEC protokoll har normalt följande egenskaper -
Känslighet (mätt som antal kontrollmålvärden behållit genom protokollet):
Totalt antal kontroll mål i elueras pärla fånga produkt (3,6) = ~ 1-20% av det totala beloppet i renat reaktion primer förlängning (2,3).
Bakgrund (mätt med 454 emPCR primer par):
Totalt antal bakgrund i elueras pärla fånga produkt (3,6) <0,01% av det totala beloppet i renat primer förlängning reaktion (2,3).
Om det är mindre än 1% av målet finns kvar i slutprodukten, kan primern förlängningen steg har tappat målet och bör undersökas.
Om det är mycket mer än 0,01% av bakgrunden kvar i de färdiga produkterna, kan tvätt steg har felaktigt utförda och bör undersökas.
Discussion
PEC Metoden är enkel, snabb, känslig och specifik. Därför har vi författarna tänka sig flera olika tillämpningar utanför forntida DNA, såsom fångst av små RNA-fragment från en RNA-bibliotek, förhör av strukturella variationen i ett samlingsprov eller fånga 16S (eller andra loci) mångfald ur ett metagenomic prov. En punkt att nämna är att känsligheten för fångst blir lägre eftersom antalet PEC grundfärg i en reaktion multiplex fånga ökar. PEC är därför inte idealisk för avskiljning av mycket stora (t.ex. ett megabase eller mer) fånga regioner, men är mycket väl lämpat för fångst av små målregioner eller ens SNP positioner från många individer på ett snabbt sätt.
Acknowledgments
Vi tackar M. Meyer för att få råd, den kroatiska vetenskapsakademin och konst samt Berlin-Brandenburg vetenskapsakademin för logistik och vetenskapligt stöd, och presidentens Innovation fonden för Max Planck-sällskapet för ekonomiskt stöd. JMG fick stöd av en NSF internationellt postdoktorsstipendium (Oise-0.754.461). Sekvenser deponeras på EBI nukleotid databasen med anslutning nummer: Neandertal 1 (Feldhofer 1) FM865407, Neandertal 2 (Feldhofer 2) FM865408, Sidron 1253 FM865409, Vindija 33,25 FM865410, Mezmaiskaya 1 FM865411
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AmpliTaq Gold polymerase with GeneAmp PCR buffer II and MgCl2 | Applied Biosystems | N8080241 | |
| QIAGEN MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| M-270 streptavidin beads | Invitrogen | 653.05 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| DynaMag-2 magnetic particle separator | Invitrogen | 120.02D |
References
- Briggs, A. W., Good, J. M., Green, R. E., Krause, J., Maricic, T., Stenzel, U., Lalueza-Fox, C., Rudan, P., Brajkovic, D., Kucan, Z. Targeted retrieval and analysis of five Neandertal mtDNA genomes. Science. 325 (5938), 318-321 (2009).
- Rohland, N., Hofreiter, M. Comparison and optimization of ancient DNA extraction. Biotechniques. 42 (3), 343-352 (2007).
- Rohland, N., Hofreiter, M. Ancient DNA extraction from bones and teeth. Nat Protoc. 2 (7), 1756-1762 (2007).
- Maricic, T., Pääbo, S. Optimization of 454 sequencing library preparation from small amounts of DNA permits sequence determination of both DNA strands. Biotechniques. 46 (1), 51-57 (2009).
- Meyer, M., AW, B. riggs, Maricic, T., Hober, B., Hoffner, B., Krause, J., Weihmann, A., Paabo, S., Hofreiter, M. From micrograms to picograms: quantitative PCR reduces the material demands of high-throughput sequencing. Nucleic Acids Res. 36 (1), e5-e5 (2007).
