Biology

העצרת, כוונון ושימוש מיקרוסקופ שדה Apertureless קרוב אינפרא אדום עבור הדמיה חלבון

Published: November 25, 2009 doi: 10.3791/1581

Melissa Paulite¹, Zahra Fakhraai², Boris B. Akhremitchev³, Kerstin Mueller¹, Gilbert C. Walker¹

¹Department of Chemistry, University of Toronto, ²Department of Chemistry, University of Wisconsin, ³Department of Chemistry, Duke University

Summary

הרכבה של מיקרוסקופ nearfield אינפרא אדום אגרגטים הדמיה חלבון מתואר.

Abstract

מאמר זה נועד להדריך את הקורא הרכבה והפעלה של מיקרוסקופ שדה ליד אינפרא אדום הדמיה מעבר לגבול השתברות. המיקרוסקופ apertureless שדה ליד הוא מכשיר פיזור אור מסוג המספק ספקטרום אינפרא אדום ברזולוציה של 20 ננומטר בערך. רשימה מלאה של רכיבים פרוטוקול צעד אחר צעד לשימוש מסופק. שגיאות נפוצות הרכבה וכוונון מכשיר הם דנו. סט נתונים נציג המציג את המבנה המשני של עמילואיד סיבית מוצג.

Protocol

רקע:

בדיקה מיקרוסקופית Apertureless שדה ליד IR מציע רזולוציה גבוהה הדמיה מרחבית. זוהי טכניקה חדשה יחסית אשר קרן אינפרא אדום האירוע מפוזר על ידי קצה חד אטומי מיקרוסקופית (AFM) כוח נדנוד בתדר התהודה של שלוחה קרוב המדגם. גלאי אינפרא אדום אוספת את אור מפוזר והוא demodulated בתדר הזה מהדהד או הרמוניות שלו. בדרך זו, לפזר את הרקע של האירוע התמקד קרן לייזר על שאר השטח מדגם יכול להיות מופחת וכן ברזולוציה מרחבית הרבה מעבר לגבול השתברות האור ניתן להשיג להשיג לעומת אינפרא אדום עם ננו ברזולוציה מרחבית ^{i, II, III} . מאז שיאו של קצה AFM הוא קטן בהרבה באזור המוקד של קרן לייזר, אור מפוזר חלש. כדי לשפר את שדה מפוזרים, זיהוי homodyne משמש שם שדה התייחסות נוספת בתחום מפוזרים אסף את השלב היחסי של השדות מוגדר כך התערבות בונה מקסימלית מתרחשת הגלאי. עוצמת פיזור אז הוא יחסית בסדר גודל של השדה החשמלי התייחסות ^{IV, VI, V.} סוגיה חשובה בתחום ההדמיה שדה ליד היא להימנע חפצים המיוצר על ידי תנועה-z של קצה AFM ^{ז, ח, ט, x, xi.} בעיה זו ניתן לצמצם עם התאמה נכונה של השלב homodyne ולמעט תכונות טופוגרפי גדול, כפי שהודגם קודם לכן על ידי מולר et al. טכניקה זו לאחר מכן השתמשו אמין כדי לקבל את ספקטרום פיזור של חומרים ניסיוניים עם רזולוציה מרחבית של פחות מ -30 ננומטר ₁₅ . השימוש במיקרוסקופ שדה ליד עבור חומרים ביולוגיים הוכח בעבר, בעיקר מקרומולקולות כגון נגיף פסיפס הטבק ^xii ו E. coli חיידקים ^xiii.

בדו"ח זה, אנו ממחישים את הרכבה של מכשיר כזה הדמיה. אנו מציגים גם מידע המבנה המשני של סיבי עמילואיד נוצר שבר # 21-31 פפטיד של β _2-m מתקבל על ידי השדה הקרוב apertureless מיקרוסקופיית אינפרא אדום (ANSIM). שדה ליד התמונות נאספות במקביל הטופוגרפיה, המאפשר זיהוי ואיסוף של ספקטרום פיזור הסיבים בודדים.

שדה ליד אינפרא אדום apertureless שלנו סריקת מיקרוסקופ (ANSIM) מדידות הוא מכשיר ביתי. סכמטי של הניסוי ההתקנה מוצג Scheme 1. מיקרוסקופ AFM (Multimode, Veeco מכשירים, סנטה ברברה, קליפורניה) משמש למדידת הטופוגרפיה של המדגם, כמו גם לייצר את פיזור שדה ליד משופר מאופנן בתדר תנודה קצה. במצב הקשה, פלטינה מצופה NSC14/Ti-Pt cantilevers (MicroMasch, אסטוניה) משמשים כדי לשפר את פיזור רציף, מתכונן לייזר IR (טווח תדירות: 2000 ס"מ ל ^-1 ס"מ ^-1 1600, PL3 לייזר גז CO, מכשירים אדינבורו, בריטניה) סמוך לפני השטח. ניאון הליום לייזר (Melles המכשף, Albuquerque, NM) שדה משמש כמדריך קרינת אינפרא אדום סמויה. אור לייזר IR הוא מופצות כלפי עדשה לאחר העברת רפלקטור חלקית ZnSe. הוא התמקד אז על השיא של נדנוד AFM קצה, עם הקיטוב של קרן מקביל לציר הארוך של החללית. קרינת IR שנאספו על ידי העדשה הוא הוסיף אז אות homodyne התייחסות. המראה paraboloidal משמש מוקד קרינה IR על גלאי אינפרא אדום קדמיום טלוריד כספית (MCT) (Graseby אינפרא אדום, אורלנדו, פלורידה). הנהג piezo (Thorlabs, ניוטון, NJ) מנוצל על מנת למקסם את האות זוהה על ידי תיקון שלב האור homodyne. מרבית הרכיבים האופטיים המתוארים לעיל הם מודבקת היטב על פלטפורמה ונעה XY או Z עמדות באמצעות הבמה translational. חלק AC של האות זוהה מועבר נעילה ב מגבר (דגם SR844 RF, Stanford Research Systems, Sunnyvale, CA) אשר demodulates את האות בתדר תנודה קצה. עוצמת פיזור הוא ציין גם את קצה AFM סורק את השטח שנדגמו הנתונים הטופוגרפיה מתקבל במקביל. התוכנה המשמשת נתונים ואיסוף התמונה Nanoscope V5.31r1 (Veeco מכשירים, סנטה ברברה, קליפורניה).

Scheme1
תכנית 1

איור 1 - מראה את חלקי מערכת הדמיה אשר הרכבה ושימוש נתאר

0) אופטי שולחן
1) מאגר של MM AFM
2) סורק של MM AFM
3) ארובה אופטיות גבוהות
(13 "x 18" x 3 / 8 ", Thorlabs)
4) המנחה מראות (מצופה זהב, 1 "קוטר).
6) קוביית אופטי w / ZnSe חלקית רפלקטור
7) צינור אופטי המשמש לאבטחת התקנה על פלטפורמת הרמת (17)
8) המטרה IR
(FL 16 מ"מ, 0.28 NA, אילינג)
9) צינור אופטי לאור גב מפוזרים שנאספו
10) קיוב w / off-ציר המראה paraboloidal
(90 °, פלורידה 5 ", יאנוש)
11) קיוב להחזיק צלחת גה @ 45 °
12) מיקרוסקופ העינית (x10)
13) XY הבמה רכוב חריר (0.5 מ"מ)
14) MCT גלאי IR (אינפרא אדום Graseby)
15) preamp IR גלאי (AC ו DC)
16) בשלב XY להעביר עמדה קרן
17) שולחן הרמת למקד את אלומת
18) Z-שלב למצב גלאי IR
19) X-שלב למצב גלאי IR

איור 1

י האסיפה ראשוני של ההתקנה האופטי

העצרת צעד I.1

להרכיב את ההתקנה אופטי עם מראות כוונון המיקום הליום נאון (HeNe) במקביל קרן לשולחן אופטי (0) בגובה הנכון כ (H) מעל קרש החיתוך אופטי (3) ומרחק (ד ') ממרכז סורק (2).

גובה זה גובה ומרחק D ניתן להעריך מגובה (H1) של המדגם על גבי הסורק (2) מהטבלה אופטי, הזווית הרצויה של שכיחות (α), גובה של החלק העליון של קרש החיתוך מעל השולחן האופטי (ח), בגדלים גיאומטריים של קוביה האופטי ואובייקטיבי IR (6 ו -8 איור 1) ואת המרחק עבודה של האובייקטיבי IR (כל ד ביחד, כאן d = 1 "2" 2 ")

איור 2
דמות 2

H = H1 + d * חטא (α)-h

D = ד * cos (α)

העצרת I.2 צעד

איור 3
דמות 3

איור 3: ללא beamsplitter בקוביה (5) עם צינור אופטי מאורך בקצה השני של הקוביה (6) הוא ישיר-Ne קרן דרך אירוסים מחוברים בקצוות של הצינורות.

העצרת צעד I.3

איור 4
דמות 4

איור 4: בעזרת סורק (2) הוסר, לצרף את צינור אופטי ארוך עם איריס בסוף במקום המטרה IR. הכנס את רפלקטור חלקית ZnSe לכוון את אלומת האור כלפי המדגם על ידי נסיעה במורד צינור אופטי ארוך. רפלקטור חלקית ZnSe צריך להיות מותקן כך הקורה HeNe פוגע במשטח מול רפלקטור במרכז הגיאומטרי של הקובייה אופטי מחזיק רפלקטור חלקית.

איור 5
דמות 5

איור 5: על ידי החלפה של רפלקטור חלקית, לכוון את אלומת HeNe דרך קשתית העין את הפלט סגור. מאז הר רפלקטור החלקי אינו מחזיק בדיוק בניצב, ישנם שני בבית מותקנת ברגים הסתגלות, המאפשר תנועה אנכית של הקורה. השתמש אותם במידת הצורך.

איור 6
דמות 6

העצרת צעד I.4

איור 6. הר המראה paraboloidal עם גומי טבעות אטימה בקוביה האופטי (ראה 1, איור 5). על ידי הידוק ברגים, טבעות האטם לדחוס, המאפשר התאמה במראה.

איור 7 דמות 7

עם מראות נוספים (אחד מוצג איור 7) לכוון את אלומת HeNe בכיוון ההפוך, כפי שמודגם על איור 7. התאם את הקורה לעבור את האירוסים השתמשו בעבר. קרן זו תשמש כדי להתאים את המראה paraboloidal.

איור 8
דמות 8

איור 8: מראה paraboloidal להציב קוביית אופטי (10) משקף את האור לעבר המיקום של הגלאי. התאמת ברגים לכוון את אלומת האור דרך חריר הניח במוצא של הקוביה (11), אשר תחזיק את החלון (גה) גרמניום. אחרי קרן מכוון דרך חריר, המקום ד MCTetector קרוב חריר. התאם את המיקום של גלאי אינפרא אדום כזה הוא Ne-הקורה על אלמנט החישה של הגלאי. הזיזו את הגלאי על ידי ~ 2 מ"מ (IR קרן יהיה מוזז למטה ליד החלון גה).

העצרת צעד I.5

איור 9
דמות 9

איור 9: הכנס את הר עם חלון גה לתוך קוביית אופטי (11). נגד השתקפויות (AR) מצופה חלון גה משמש מסנן IR ותצפיות היתרי חזותי של שלוחה ואת המדגם. הצמד את העינית (12). זווית פיתול של הקוביה (11) ביחס קוביה (10) מאפשר נקודת העינית בכיוון הרצוי. על ידי החלפה של הר של החלון גה, הקורה HeNe מכוונת דרך באמצע העינית.

איור 10
דמות 10

איור 10: חיבור IR אובייקטיבי (8) ו AFM סורק (2). צרף את beamstop לסיים את הפלט של הצינור האופטי (5). שימוש במסנן מגן בעת הצגת קרן HeNe דרך העינית. מיקום מדגם בסורק ולכוון את אלומת HeNe דרך הצינור קלט אופטי (5). ודא קרן HeNe הוא רחב מספיק כדי לשפוך על beamstop. Beamstop משמש בגלל המטרה Cassegrain, אשר רק אוספת האור הנכנס מהפריפריה של הקורה. על ידי התאמת חוט של העינית תמונה חדה של הקורה HeNe התמקד במדגם מתקבל.

העצרת צעד I.6

ההתאמה הסופית של המראה paraboloidal נדרשת. חריר התפוקה מוחלף איריס במיקום המוקד של המראה paraboloidal. הסר את חלון גה ו גלאי IR (עמדה בסימן של גלאי אינפרא אדום!). צרף עדשה נוספת לאחר איריס ב אורך המוקד של העדשה משוער של איריס. ברגע זה שלוחה עוסקת צריך להיות גלוי דרך העדשה. התאם את המיקום של המראה paraboloidal למרכז סוף של קצה באמצעות הקשתית סגורה. שים לב שכאשר קרן HeNe ממוקדת כהלכה על קצה, זה עושה ניצוץ בהיר בין עצה לבין השתקפות של זה על פני השטח של המדגם. Re-לצרף את החלון גה; להתאים אותו לצורך השגחה חזותי נוח של שלוחה. החלף את הקשתית עם חריר ו לזכור כי חריר משמש לגילוי IR צריך להיות מוזז מחוץ למרכז בשל עקירה קרן אינפרא אדום ליד החלון גה. מניחים את גלאי IR במיקום המסומן בעבר.

לבסוף, לכוון את אלומת IR כך שהוא נוסע יחד עם הקורה HeNe גלוי לשמש כוונון.
עכשיו הכל צריך להיות מוכן התאמה שגרתית.

התאמה שגרתית:

התאמת צעד נ '-1:

יישור עם HeNe-לייזר

קל יותר להתיישר עם HeNe הנראה (632nm) מאשר עם IR בלתי נראה (סביב 6μm).

נתיב HeNe ושל הקורות IR מתכנסים יחד במראה tiltable. אם זה במראה מוטה כלפי מטה HeNe יכול לעבור, אם המראה נמצאת בעמדה קרן IR מתפשטת להתקנת שדה ליד. עבור היישור של אחד הקורות בלבד, להשתמש שתי מראות לא במשותף עם השביל אחרים ממוקמים מול המראה tiltable. אם יש לך עבר בטעות אחר מראה, לנסות תחילה להביא את המראה בחזרה בעמדה הישנה שלו.

A.1.1. יישור גס עם שתי מראות

השתמש שתי מראות קרוב הלייזר HeNe כדי ליישר את קרן דרך כל אירוסים לאורך השביל לשלב הקרוב בתחום. אם אתה מסתכל על הקורה בזרוע homodyne, פרופיל הילה, כמו קרן יש לשים לב (עקב חוסם את אלומת האור בתוך צינור אופטי). זה מצביע על כך הקורה עובר ישר דרך הצינורות.

A1.2. יישור פיין עם שלב שדה ליד

צרף את הראש AFM ולעסוק קצה שלוחה על המדגם. פוקוס אלומת HeNe אל הקצה של שלוחה הדמיה. אם עושים כך מחליף את קרן מאמצע הצינור קלט אופטי (5) כוונון חזור על שלבים נ '-1. ו A.1.2. עד הקורה מרוכז.

על ידי הזזת הבמה אופטי translational, המטרה מיקרוסקופ המשקף מותאם למקד את האור על הקודקוד של קצה שלוחה, שבו הוא מפוזר.

סובב את המראה גה מתחת לעינית (הממוקם בקוביה אופטי) ו להסתכל דרך העינית. הקרן מתמקדת בשלב זה (או על גלאי אינפרא אדום כאשר את המראה גה הוא שלף של הקוביה) על ידי המראה paraboloidal. הזז את הבמה אחורה או קדימה עד תמונה חדה של קצה והשתקפות שלו על פני השטח מדגם הוא ציין. שימוש שני oיש כיוונים (למעלה / למטה ימין / שמאל) למקום קצה AFM בערך באמצע העינית.

במבט מבעד לטלסקופ, שלוחה AFM ו קצהו הוא ציין. שוב, זכרו להשתמש במסנן הגנה בעת הצגת קרן HeNe. ללא הקורה HeNe, קצת אור אדום הוא ציין עדיין שמקורו האור הפנימי של שליטה מרחוק AFM. הזז את שלב ב translational זכות השמאלית ו / או למעלה למטה לכיוון עד ניצוץ אדום בוהק הוא ציין על קצה הקודקוד. אם היישור הוא רע למדי, להעביר את הבמה משמאל AFM ולעבור ימינה לאט. Watch עבור השתקפות אדום נע על פני המדגם רעיוני. אם השתקפות אדום עדיין לא נצפתה, לתרגם את הבמה משמאל שוב להעביר בצורה למעלה למטה. שמור תרגום משמאל לימין, למעלה למטה עד ניצוץ אדום הוא ציין כפי שאתה למקד את אלומת HeNe על הקודקוד של קצה AFM.

A1.3. חופפים את השדה homodyne עם אור מפוזר

פתח את הזרוע homodyne ולחפש יסודית את העינית. שלוש נקודות או יותר בקו בעוצמה ירידה נתפסת כתמים אלו הם תוצאה של השתקפויות מרובות הקדמי וישבנים של אופטיקה שונה. הזז את המראה בזרוע homodyne כך את המקום השני (מלמטה בעוצמה) חופף עם התמונה בהירה של קצה, שבה קצה והשתקפות שלו באים יחד.

A1.4. מקם את הגלאי

הסר את המראה גה ואת קרן HeNe צריך ללכת בכיוון שבו גלאי IR נמצא. מאחורי צינור אופטי, שתי נקודות ringlike הם נצפו. במקום השני (בעוצמה) הוא המקום כי צריך ללכת דרך החור של נייר חום והגנה על פניו של גלאי אינפרא אדום. נקודה בעוצמה הגבוהה ביותר יש לראות על גבול החור.

A1.5. שינוי ממדגם אחד למשנהו

לאחר שינוי המדגם קצה AFM כבר לא באותה תנוחה בדיוק כמו קודם, אבל לא צריך להיות יותר מדי רחוק. התחל עם צעד A.1.2, שכן ההבדל הוא בדרך כלל לא גדול מאוד.

הערה: אם יישור כבויה, לבדוק אם קרן HeNe עדיין עובר כל האירוסים ויוצר ניצוץ אדום בוהק על קצה AFM. לפעמים אתה לא שם לב שיש לך נגע ולכן עבר מראה מהמיקום המקורי. אם היישור הוא עדיין גרוע, למרבה הצער הליך יישור כולו להסתיים שוב.

התאמת שלב 2: יישור IR Beam

השתמש לייזר CO גבוהה בקנה אחד עם העוצמה / כוח (לפחות 100 mW) כמו זו יהפכו את יישור קל. מלאו את גלאי עם חנקן נוזלי ולתת לו לאזן לפחות 30 דקות.

2.1. יישור גס עם שתי מראות

מניחים מד הכוח מאחורי הקשתית הראשונה לפקח על כוחה של קרן האינפרא אדום נכנסות. לאחר מכן, להתאים את המראה הנמצא לפני המראה tiltable כדי לקבל את הקריאה הגבוהה ביותר כוח. קח את מד הכוח והחזק אותו מאחורי הקשתית שהוא הקרוב ביותר בשלב הקרוב בתחום ולהתאים את המראה tiltable עד קריאה הכוח המרבי מתקבל. חזור על שלב זה כמה פעמים התאמה אופטימלית.

2.2. צפייה אותות 1f

ההתייחסות של נעילה ב מגבר חייב להיות מוגדר לבודד את תדירות תדירות תנודה טיפ ידי הגדרת אותו 1F (שלוחה), המהווה את תדירות תנודה AFM. הגדר את גודל סריקה במצב כוח העלילה בתוכנה Nanoscope עד 3 מיקרומטר. לאחר תקנון גס ב 2.1., לחפש הצורה הנכונה של האות 1F. בשלב הבא, לכוון את השלב בין האור מפוזר שנאספו קצה והאור homodyned מהזרוע homodyne ידי התאמת הנהג piezo. זה מניע את המראה בזרוע homodyne ידי שינוי המתח של piezo כך המינימום הראשון של האות 1F הוא סביב 500 ננומטר להתחיל מאפס. מכיוון שכל שינוי יישור תשנה את אורך שני נתיבים של אור, ולכן שלבים היחסי שלהם, השלב צריך להיות מתוקן עם piezo.

מה אתה תראה (1f אות)?
Bad המערך:	שתי בליטות בגודל 3 מיקרומטר z לסרוק יקויימו.
בינוני המערך:	עקמומיות של בליטה הראשון נראה קצת קעור יותר קמור ואת להקפיץ השני הוא קטן יותר מאשר את הראשון.
(כמעט) טוב המערך:	שתי בליטות יקויימו. המכה הראשונה היא גבוהה יותר מאשר להקפיץ את השני, ואת עקמומיות בצד ימין של להקפיץ את הראשון יהיה שלילי (קעור).

מה ניתן לעשות ליישור?
Bad יישור:	חזור על הליך יישור בשלב 2.1 כנדרש. בגלל קוטר אלומת IR הוא גדול, רוב הקורה יעבור את האירוסים אפילו אם הוא לא מיושר לגמרי. גם אם שתי בליטות נשמרים עדיין, כמות האות 1F יכול להיות מוגברת על ידי כוונון אחד או שני המראות יישור. Watch עבור שינויים קלים העקמומיות של מכה ראשונה. יותר מכל, להיות סבלני שכן זהו החלק הקשה ביותר של המערך.
בינוני המערך:	נסו להתאים את אחד או שני המראות יישור להשיג יישור טוב כמעט. נסה להזיז את הבמה XYZ translational גם כן, אבל זאת על ידי התאמת במרווחים קטנים מאוד.
(כמעט) טוב המערך:	כוונו את המראות ולנסות להגדיל את מקסימום להקפיץ את הראשון. אותות 1F הם בדרך כלל סביב V 8-16, עבור כוחות קלט נמוך זה פחות. שנה את השלב על ידי שינוי מתח באמצעות הנהג piezo כך המינימום הראשונה מגיעה קרוב לאפס. אם יש איתות משמעותי 1F, הבורר התייחסות של נעילה ב מגבר לבודד את האות 2F. חלק האות יש לשים לב ולנסות לשפר אותו קצת יותר על ידי מעט מאוד כוונון מראות שינוי פאזה.

2.3. שינוי ממדגם אחד למשנהו

בצע שלב A.1.5 תחת יישור הקורה HeNe. Engage קצה AFM ולהפיץ את קרן IR מבעד למיקרוסקופ. צפה אות 1F. אם אות 1F הוא ציין עוד, להתאים את המראה tiltable ולהתאים את השלב. טוב אם האות, ולכן האות 2F טוב, עדיין עשויים להיות שנצפו. אם לא, דק ליישר את הקורה באמצעות צעד 2.2.

נציג תוצאות:

הכנת המדגם הפפטיד # 21-31 היה מסונתז במרכז ביוטכנולוגיה Bioengineering באוניברסיטת פיטסבורג מטוהרים (> 95%) על ידי HPLC. כדי לסנתז את סיבי עמילואיד, 0.8 מ"ג TMAO (סיגמא אולדריץ) נוספה בתמיסה של 1 מ"מ # 21-31 פפטיד במים MΩ 18, בדומה לנוהל להורג על ידי יאנג et al. ^Xiv

Ultraflat זהב מצעים ^xv נעשו. 40 μL של פתרון לחודש אחד הישן (בטמפרטורת החדר הדגירה, pH 5.5) הופקד במשך מספר דקות על גבי מצעים זהב טרי ultraflat. הם היו שטופים בקצרה עם זרם של מים MΩ 18, מיובשים עם זורם N ₂ גז ממוקם במכשיר ANSIM.

איור 11 מציג את הטופוגרפיה ואת שדה ליד תמונות שנאספו עבור # 21-31 הסיבים פפטיד. א) התמונה טופוגרפיה שהושגו בעת ובעונה אחת עם התמונה המתאימה כמעט בתחומה. תוויות מייצגים הסיבים הפרט משמשים התכונה סוג של קונפורמציה משני סיבית לכל. שדה ליד מקבילים B ו-C) תמונות שנאספו בשני wavenumbers שונים: 1631 ו - 1691 ^-1 ס"מ. שטח כל תמונה היא 1 x 1 ² מיקרומטר. סולם השמאל מייצג גובה, היקף הזכות הוא השדה מפוזרים מן נעילה ב מגבר.

איור 11
דמות 11