Électrofilage treillis polymères fibreux pour l'ingénierie tissulaire et de la culture cellulaire

Summary

Le processus de électrofilage de polymères pour l'ingénierie tissulaire et de culture cellulaire est abordée dans cet article. Plus précisément, l'électrofilage des macromères photoréactif avec des capacités de traitement supplémentaires de photopatterning et multi-polymère électrofilage est décrite.

Abstract

Comme le domaine de l'ingénierie tissulaire évolue, il ya une demande énorme pour produire des matériaux plus adaptés et les techniques de transformation afin de répondre aux exigences (par exemple, la mécanique et la vascularisation) des organes plus complexes et les tissus. Électrofilage est une technique populaire pour créer des échafaudages fibreux qui imitent l'architecture et de l'échelle la taille de la matrice extracellulaire native. Ces échafaudages fibreux sont également utiles comme substrats de culture cellulaire, car les fibres peuvent être utilisés pour diriger le comportement cellulaire, y compris la différenciation des cellules souches (voir examens approfondis par des Mauck

Protocol

A. seul polymère Électrofilage

1. Avant de préparer la solution électrofilage, faire une solution à 0,5% en poids du photoamorceur, Irgacure 2959 (I2959), dans l'eau déminéralisée en dissolvant à 37 ° C pendant plusieurs jours. Cette étape n'est pas nécessaire si un polymère photoréactif n'est pas utilisé.
2. Combinez méthacrylatée acide hyaluronique (Meha, voir Burdick et al. Pour la synthèse), le poly (oxyde d'éthylène) (PEO, 900 kDa), et I2959 dans l'eau désionisée pour préparer une solution avec une concentration finale de 2% en poids Meha, 3% en poids % en poids de PEO, et 0,05 I2959. Utilisez un vortex pour mélanger la solution jusqu'à ce qu'elle soit claire. Le type de polymère et de concentration, ainsi que le solvant utilisé peut être modifié à cette étape, selon les propriétés souhaitées échafaudage.
3. Transférer la solution dans une seringue et fixer une jauge de 18, 6 pouces de long, l'aiguille extrémité émoussée à la fin.
4. Programme d'une seringue pour éjecter à un taux de 1,2 ml / hr. Insérer la seringue et l'aiguille dans le dispositif.
5. Fixez le fil à la terre d'une source d'alimentation haute tension de l'appareil de collecte. Pour collecter les fibres aléatoirement distribués utiliser une plaque de métal plat, ou d'utiliser un mandrin en rotation à ~ 10 m / s pour recueillir des fibres alignées. Fixez la tête chargée positivement à l'aiguille. Voir Figure 1 pour un schéma de l'appareil électrofilage.
6. Ajuster l'aiguille ou d'un dispositif de collecte, de telle sorte que il ya une distance de 15 cm entre les deux.
7. Démarrer le flux de la pompe à seringue. Lorsque le liquide est visualisée sur la pointe de l'aiguille, tournez sur la source d'alimentation et régler la tension à 22 kV.
8. Après la collection est complète (de quelques minutes pour les films minces, jusqu'à 24 heures pour un matelas plus épais), enlever l'échafaud de l'appareil de collecte et de le stocker sous vide pendant une nuit pour assurer l'élimination complète du solvant.
9. Visualisez la morphologie des fibres par microscopie électronique à balayage (MEB), un échafaudage représentatif est montré dans la figure 1 pour les deux structures alignées et non-alignés.

Remarque: Le débit de l'échantillon, la distance à l'appareil de collecte, et la tension dépend de la combinaison de polymères et de solvants et doivent être optimisés pour chaque système, généralement par l'observation de la morphologie échafaud avec SEM.

Photoréticulation B. et Photopatterning

1. Découpez 5mm X 5mm échantillons du tapis échafaud.
2. Préparez-vous à réticulation en plaçant chaque échafaudage sur une feuille couverte lame de verre, en plaçant le photomasque directement sur l'échafaud, couvrant avec une lame de verre propre et écrêtage deux extrémités avec pinces pour reliure. Remarque: quatre échantillons qui peut être fait à la fois, et une transparence sans un motif peut être utilisé pour la réticulation si un motif n'est pas souhaitée.
3. Purger échafaudage mis en place dans une chambre d'azote. Il est important de garder le concept exempt d'oxygène, qui peuvent inhiber la réticulation.
4. Placez échafaudage de configuration dans la chambre de l'azote sous ~ 10 mW / cm ² de lumière de 365 nm avec un adaptateur collimation pendant 5 minutes. Voir schéma de la figure 2.
5. Retirez chaque échafaudage et le placer dans une plaque 12 puits.
6. Ajouter 2 mL d'eau déminéralisée dans chaque puits, la plaque de parafilm pour éviter l'évaporation de l'eau et placer à 37 ° C pendant 24 heures. Changez l'eau trois fois.
7. Visualisez formation de pores au microscope optique (voir exemple en figure 2). Les échafaudages sont maintenant prêts à utiliser.

Remarque: photoréticulation n'est pas nécessaire pour de nombreux types de polymères, cependant photopatterning ne peut être utilisée avec des polymères photoréactifs.

C. Double Polymer électrofilage avec fluorescent visualisation fibre

1. Préparer une solution à 5% en poids de PEO (200 kDa) dans l'éthanol à 90%. Incorporer à 700 rpm à 50 ° C pendant au moins 2 heures avant électrofilage.
2. Transférer la solution de PEO à une seringue et ajouter DAPI pour une concentration finale de 10 mg / mL dans la solution électrofilage. Enveloppez la seringue dans l'aluminium pour le protéger de la lumière.
3. Préparer la même solution décrite dans l'étape A2, à l'exception également ajouter méthacryloxyéthyle thiocarbamoyle rhodamine B (MeRho, 683,24 g / mol) pour une concentration finale de 25 pM dans la solution électrofilage. Enveloppez la seringue dans l'aluminium pour le protéger de la lumière.
4. Soigneusement utiliser du scotch pour sécuriser des lamelles en verre méthacrylatée (voir Khademhosseini et al.) À la surface du mandrin. Remarque: les fibres deviennent attachés à lamelles de verre méthacrylatée.
5. Fixez une extrémité d'un morceau de 5 mm de long tube en silicone avec des pièces jointes luer lock à l'un des seringues et attacher l'autre extrémité à une aiguille. Insérer la seringue dans le pousse-seringue et mettre l'aiguille à travers le trou dans le paysan. Répétez avec l'autre seringue et paysan sur le site en face du mandrin. Les vanneurs traduire le longueur du mandrin et sont utilisés pour assurer une distribution égale des deux polymères résultant de la échafaud. Voir schéma de la figure 3.
6. Ajustez les paramètres décrits dans la Section A de façon appropriée conformément au Tableau 1. S'assurer que les pointes d'aiguille sont centrées sur le mandrin.
   
   Tableau 1. Double Polymer Paramètres Électrofilage
   

   Seringue	Paysan à la pointe de l'aiguille (cm)	Pointe de l'aiguille à mandrin (cm)	Débit (ml / h)	Tension appliquée (kV)
   Meha	6	15	1.2	22
   PEO	6	10	1.2	15

   
   
7. Une fois que tout est correctement aligné, éteignez les lumières et tourner sur le mandrin et le pousse-seringues. Retirer le papier d'aluminium à partir des seringues. Lorsque le liquide est visible sur la pointe des deux aiguilles, tournez simultanément sur les blocs d'alimentation et branchez le vanneurs.
8. Lorsque la collecte est terminée, éteignez l'alimentation et le mandrin et débranchez le vanneurs. Retirez délicatement les lamelles et le ruban à l'aide d'une lame de rasoir.
9. Visualisez les fibres en utilisant un microscope à fluorescence équipé de filtres pour la rhodamine et DAPI. Voir l'exemple en figure 3. Remarque: fibres fluorescentes sont les plus clairs pour voir où électrofilé pour de courtes périodes de temps (<3 minutes), cependant, ce processus peut être prolongée pour une durée illimitée afin de créer des constructions plus épais, surtout sans l'utilisation de l'lamelles de verre .

Cellules ensemencement D. sur les échafaudages

1. Placez chaque lamelle avec électrofilé polymères attachés à un individu puits d'une plaque de taille appropriée ainsi. Note: les interactions cellulaires avec les fibres sont facilement visibles par électrofilage sur des lamelles de verre méthacrylatée. En outre, MeRho peut à nouveau être utilisé pour la visualisation de la fibre.
2. Incuber les échafaudages en PBS nuit pour assurer une élimination complète du solvant et de toute lixiviables éventuels sous-produits.
3. Retirez le CPE dans les puits.
4. Pour stériliser les échafaudages, les placer sous une lampe germicide dans une hotte à flux laminaire pendant 30 minutes. Si une pleine échafaudage est ensemencé, flip sur l'échafaud et placer sous une lampe germicide pour un autre 30 minutes.
5. Effectuer culture cellulaire standard et préparer une suspension cellulaire concentrée à la densité cellulaire désirée (par exemple, 6.000 cellules cm ^-2). Par exemple, utiliser 100 ml de suspension cellulaire pour une lamelle de 22 mm x 22 mm. Placer dans l'incubateur pendant 1 heure.
6. Ajouter la quantité appropriée de milieux de culture cellulaire à chaque puits. Placez les échafaudages de nouveau dans l'incubateur.
7. Colorer les cellules en utilisant un kit disponible dans le commerce Live / Dead. Remarque: d'autres types de coloration des cellules, telles que le DAPI (noyaux cellulaires) et marqué par fluorescence phalloïdine (fibres de stress d'actine) peut être appliqué à visualiser les cellules.
8. Visualisez les cellules et les fibres en utilisant un microscope à fluorescence équipé de filtres pour TRITC et FITC. Voir l'exemple à la figure 4.

Les résultats représentatifs:

Figure 1. Schéma illustrant la configuration du périphérique pour la formation d'échafaudage non-alignés (en haut) et aligné échafaudage de formation (en bas). Exemple de numérisation d'images en microscopie électronique de chaque type d'échafaudage sont affichés. Barre d'échelle = 5 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de la figure 1.

Figure 2. Schéma de la méthode de structuration. Les motifs sont formés en plaçant un photomasque entre la source de lumière et d'échafaudage lors de photoréticulation puis emportant polymère inaltéré. L'image photomasque et SEM d'échafaudages, après formation de pores et la lyophilisation. Barre d'échelle = 100 pm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de la figure 2.

Figure 3 Schéma de la configuration multi-polymère et les paramètres électrofilage de traitement nécessaires, ainsi qu'une image représentative fluorescente d'un mélange de deux populations de fibres (par exemple: rouge et bleu Meha PEO). Qui ont été simultanément électrofilé pour former un échafaudage multi-polymère . Barre d'échelle = 100 pm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une plus grande version de la figure 3.

Figure 4. Un exemple d'image coloration Live / Dead de cellules souches mésenchymateuses humaines et leurs interactions avec les fibres électrofilé. Barre d'échelle = 100 pm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de la figure 4.

Discussion

Électrofilage a été utilisé pour préparer des échafaudages fibreux à partir de polymères. Photoréticulables échafaudages à base d'acide hyaluronique ont été utilisés comme un exemple illustratif, où l'exposition de lumière est nécessaire à la réticulation. Avec l'utilisation de macromères réactives, telles que Meha, les canaux qui ont déjà démontré améliorée distribution cellulaire ont été incorporées dans les échafaudages avec l'utilisation d'un masque pendant photoréticulation pour former échafaudages macro et micro-poreux. Par ailleurs, deux polymères distincts ont été simultanément électrofilé utilisant notre appareil personnalisés. La présence de deux populations distinctes de fibres a été vérifiée avec l'ajout d'un colorant fluorescent à chaque solution électrofilage, qui fut plus tard considéré en utilisant un microscope à fluorescence. Multi-polymère échafaudages peuvent être utilisées pour améliorer la distribution cellulaire, ainsi que de mieux ajuster la mécanique et la dégradation d'un échafaudage pour une application particulière par rapport à seul polymère échafaudages électrofilé. Par ailleurs, la stérilisation et l'ensemencement des cellules de l'échafaudage a été démontrée. Beaucoup de ces techniques sont polyvalentes et peuvent être utilisés pour toute une gamme de différents polymères pour fabriquer des échafaudages divers pour des applications en génie tissulaire et à la culture de cellules.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
DAPI	Reagent	Invitrogen	D1306
I2959	Reagent	Ciba Specialty Chemicals
PEO 200 kDa		Polysciences, Inc.	17503
PEO 900 kDa	Reagent	Sigma-Aldrich	189456
Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B	Reagent	Polysciences, Inc.	23591-100	Prepare stock solution in DMSO
Live/Dead Stain Kit	Reagent	Invitrogen	L3224	Contains Calcein (stains live cells green) and ethidium homodime (stains red dead cells)
Syringe Pump	Equipment	KD Scientific	KDS100	Two are needed for dual polymer spinning
Power Source	Equipment	Gamma High Voltage	ES30P-5W	Two are needed for dual polymer spinning
Motor	Equipment	Triem Electric Motors, Inc	0132022-15	Must attach to a custom built mandrel
Tachometer	Equipment	Network Tool Warehouse	ESI-330	Use to monitor mandrel speed
Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter	Equipment	EXFO	S1000
Silicone Tubing	Equipment	McMaster-Carr	51135K151
Luer Lock Female Adapter	Equipment	McMaster-Carr	51525K293
Luer Lock Male Adapter	Equipment	McMaster-Carr	51525K143
Needles	Equipment	Fisher Scientific	14-825-16H
Coverslips	Equipment	Corning	2875-22