Nichtinvasive In Vivo Small Animal MRI und MRS: Basic Experimentelle Verfahren

Summary

Diese Arbeit beschreibt die grundlegenden Verfahren der nichtinvasiven Kleintier-MRT und MRS

Abstract

Kleintier-Magnet-Resonanz-(MR-) Forschung als ein wichtiges Element der modernen biomedizinischen Forschung aufgrund ihrer nicht-invasive Natur und den Reichtum der biologischen Informationen, die sie bietet entstanden. MR benötigt keine ionisierende Strahlung und kann nicht-invasiv eine höhere Auflösung und bessere Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zu anderen tomographischen oder spektroskopischen Modalitäten. In diesem Protokoll werden wir uns auf kleine Tier MR-Bildgebung und MR-Spektroskopie (MRI / MRS) Fokus auf nicht-invasiv zu erwerben Entspannung gewichteten

Protocol

Teil 1: Magnet Sicherheit

Beide MRT und MRS mit einem starken Magnetfeld, dass äußerste Vorsicht erfordert. Zum Beispiel hat der 4,7 T Instrument, das wir für die vorliegende Arbeit verwendet ein Magnetfeld rund 90.000-mal das Erdmagnetfeld. Die hohe magnetische Feld ist immer auf, auch wenn die MR-Scanner nicht benutzt wird. Alle metallischen Gegenstand in Berührung mit einem derart hohen Magnetfeld kommt, wird stark und schnell durch den Magneten angezogen werden. Es ist äußerst gefährlich, wenn eine Versuchsperson oder Betreiber in das Projektil Weg durch einen metallischen Gegenstand fliegen in den Magneten befindet. Deshalb sollte Personal, das MR Experimente darauf achten, alle metallischen Gegenstände aus ihrer Kleidung zu entfernen, bevor sie die Nähe des Gerätes und auch pflegen die Umgebung frei von solchen Objekten. Nähere Informationen über Magnet Sicherheit wird in der Literatur ¹ und die folgende Webseite: http://www.imrser.org/ . Die Anwesenheit von metallischem Material kann nicht nur zu den genannten Sicherheits-Problem, aber stören experimentellen Ergebnisse durch Induktion Imaging / spektroskopische Artefakte. Das metallische Material präsentieren in der Nähe oder innerhalb der Imaging-Objekt kann das Magnetfeld in der Nähe zu verändern und so zu Artefakten auf aufgenommene Bilder oder erweitern Linienbreite von Spektren.

Dementsprechend lassen Geldbörse, Schlüssel, Stifte, etc. außerhalb des Magneten, wenn Sie Tiere Griff für MR Verfahren.

Teil 2: In-vivo-MRT der Maus in eine horizontale Bohrung Magnet

Tierische Vorbereitung für MRI

1. Alle Tiere sollten von der institutionellen Pflege der Tiere und die Nutzung Ausschuss (IACUC) vor dem Ausführen von Arten der Behandlung der Tiere genehmigt werden.
2. Wir verwenden verdampft Isofluran, Tiere für MRI Experimente zu betäuben. Anästhesie der Tiere können durch andere Anästhetika, wie Avertin (2,2,2-Tribromethanol oder FSME) und einem Cocktail von Ketamin und Xylazin erreicht werden. Dosierung Informationen der einzelnen Betäubungsmittel ist in Tabelle 1 zu finden.
3. Linie eine Induktion Kammer mit Kunststoff-Backed Saugkissen (blau-Pad oder Futter). Legen Sie eine Maus (oder mehrere Mäuse für Multi-Maus-imaging) bei der Induktion Kammer.
4. Stellen Sie den Durchfluss der Isofluran Verdampfer auf 0,8 1,5 L / min. Dann passen Sie die Isofluran-Verdampfer bis 4% für etwa 2 3 Minuten.
5. Nach dem Erreichen der operativen Ebene der Anästhesie (dh keine Spur Prise response), statt mit der Maus auf ein Tier-Halter mit seiner Nase in einem Nasenkonus (oder Maske) eingefügt. Ein Kopf restrainer können für Kopf-Bildgebung verwendet werden und ein Körper Halter kann für Körper Bildgebung verwendet werden.
6. Tierhaltung eingesetzt werden, um mögliche Bewegung zu verhindern: Es gibt mehrere Arten von kommerziellen Inhaber. Außerdem kann ein kundenspezifisches Halter hergestellt werden, um speziellen Anforderungen eines Versuchsaufbaus unterzubringen. Für eine maßgeschneiderte Halter, vergewissern Sie sich, um nur nicht magnetischem Material zu verwenden.
7. Während der Bildgebung Zeit, stellen Sie den Durchflussmesser 0,4 0,8 mL / min und reduzieren die Isofluran-Verdampfer bis 1,2 1,5%. Das ausgeatmete Gas aus der Maus Nasenkonus wird durch eine Pumpe gesammelt und entfernt in eine in-house Vakuum.
8. Die Augen des Tieres wird feucht gehalten mit einer sterilen Auge Schmier-Salbe sein. Das Tier wird bei 35-37 ° C während des Experiments in einem warmen Wasserkreislauf gehalten werden. Andere Arten von Wärmequelle wie beheizte Pads und warme Luft in die Radiofrequenz-(RF)-Spule durchgebrannt verwendet werden.
9. Ein Tier Monitoring-System ist vorhanden, um die Körpertemperatur, Atmung / Herzzyklus zu überwachen und zu synchronisieren Atmung / Herz-Gating mit Bildaufnahmen.
10. Ein Standard-Probe von Agarose hergestellt wird neben dem Tier abrupt Signaländerung Monitor platziert. Diese Standard-Agar-Probe ist besonders nützlich für Multi-Slice-und Multi-Zeit-Punkt Bildgebung. Wenn eine unerwartete Signaländerung in einem Stück aus den aufgenommenen Bildern erkannt wird, kann die Scheibe mit dem unerwarteten Signaländerung beseitigt werden. Darüber hinaus können ihre Signalintensitäten anhand des Signals ändert die Standard-Probe während der post-Bildanalyse eingestellt werden.
11. Nach sichere Platzierung der Tier-und Monitoring-Komponenten auf der Tierhalter, Position der Tierhalter in der Mitte einer HF-Spule.
12. Bewegen Sie den HF-Spule um den Magneten Raum und legen Sie die HF-Spule in das warme Wasser Kreislauf-System innerhalb des Magneten platziert. Abbildung 2 zeigt mehrere Komponenten eines MRT-Scanners von der Vorderseite des Magneten beobachtet Bohrung.

MRI-Experiment

1. Tune die HF-Spule, die ¹ H-Resonanzfrequenz und entsprechen der charakteristischen Impedanz der Spule 50 Ohm mit dem Tuning Panel in den MR-Scanner. Dies ist, um optimale Bedingungen der Signalempfang zu erreichen. Die meisten Menschen MRI-Scanner benötigen keinen separaten Prozess von tune / Spiel außerin MRS Verfahren.
2. Führen Sie eine Shim-Prozess mit einem einzigen Impulsfolge. Eine MR-Signal setzt auf die Umwelt Magnetfeldhomogenität. Die shimming Verfahren ermöglicht das Magnetfeld in der Region von Interesse zu sein so homogen wie möglich. Jedes MR-Scanner verfügt über einen eigenen Weg, um die Shim-Prozess, einschließlich der automatischen schnell shimming Prozesse wie schnell Karte und Gradientenshimmen durchzuführen.
3. Optimieren Sie die HF-Pulses durch die Maximierung eindimensionales Bild Profil. HF-Pulses Befugnisse angeordnet, während die Pulsdauer konstant und eine ausreichend lange TR (recycle Verzögerung), dass etwa 3 ist - 5x die T ₁ des Gewebes.
4. Erwerben Sie scout Bilder in drei orthogonalen Richtungen, um eine axiale, koronale und sagittale Bilder zu erstellen. Eine schnelle Bildaufnahme-Sequenz (dh Gradientenecho oder schnelle Spin-Echo-Bildgebung Sequenz) kann der Scout Bilder zu erwerben. Die aufgenommenen Bilder werden verwendet, um für die eigentliche Bildgebung mit der Bestimmung der Bildebenen zu planen.
5. Wechseln Sie auf Spin-Echo-Sequenz. Wählen der richtigen Reihenfolge Parametern: TR (recycle Verzögerung) sollten drei vor fünf Mal das Gewebe T ₁ bis völlig entspannt Bilder wie Protonendichte oder T _{2-gewichteten} Bilder zu erwerben. TE (Echozeit) ist die Zeitdauer zwischen der ersten HF-Puls und dem Zentrum von echo-Signal. Ein TE-Wert kann je nach den Bildkontrast, wie in Tabelle 2 zusammengefasst ausgewählt werden. Abbildung 2 zeigt in vivo Bilder mit unterschiedlichen entspannende Wirkung von T _1, T ₂ und T ₂ * für eine Nacktmaus mit einer Xenograft Tumor auf dem Rücken erworben.
6. T _2-Messungen können durchgeführt entweder mit multiecho Bildgebung oder einzelne Echo-Bildgebung mit mehreren TE-Werte sein.
7. Im Anschluss an die MRI / MRS in vivo Experiment sollten die Tiere während des Recovery-Prozess überwacht werden. Nach der MR-Bildgebung werden die Tiere aus der HF-Spule aufgenommen und überwacht werden, um vollständige Genesung zu gewährleisten, wenn sie den Käfig zurück. Der Wärmeverlust ist bei narkotisierten Mäusen schnell. Halten Sie die Tiere warme durch Abdecken mit Gaze-Pads oder Handtüchern und / oder die Bereitstellung einer Wärmequelle bis die Tiere aus der Narkose gewonnen werden.

Image Processing

1. Bewertung aufgenommenen Bilder auf dem MR-Konsole und von ausgewählten Daten an ein Post-Processing Computer.
2. Wir verwenden in der Regel ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) zur Analyse von Bildern. Die Bildanalyse umfasst Bildskalierung /-Filterung, Berechnung von T _1, T ₂ und Diffusion, Tumorvolumen Messungen und Segmentierung von Tumoren.

Teil 3. In Vivo MRS für Mouse Hinterlauf Skelettmuskulatur in eine vertikale Bohrung Magnet

Bau der Manschette zur Induktion Reversible Ischämie

1. Beginnen Sie mit einem Stück PVC-Rohr, dass etwa 5-7 mm breit mit einer ID von 12-15 mm ist. Bohren Sie ein kleines Loch durch die Wand von diesem Stück und Faden.
2. Schneiden Sie ein Stück Ballon so dass es an beiden Enden offen ist (Helium Ballons Qualität der Arbeit am besten). Legen Sie dieses Stück durch die PVC Stück und wickeln sich wieder um und Bandenden zusammen an der Außenwand des PVC Stück.
3. Verwenden Sie Schrumpffolie, um den Ballon Dichtung endet um das Rohr. Sie sollten über eine Manschette mit einem festen Außenwand und einem aufblasbaren Innenwand.
4. Schneiden Sie eine Fläche von Schrumpf-und Ballon rund um die Gewindebohrung, wobei darauf zu viel Material zwischen dem Loch und der Kante des PVC Stück verlassen. Themen ein 1,5 cm großes Stück NE-Metallen (zB Messing) in das Loch in der PVC. Damit können Sie die Manschette aufzublasen. Seal Bereich mit 5 Minuten Epoxy.
5. Fix diese Manschette in Platz neben dem HF-Spule in der MRS-Sonde und eine Verbindung zu einem externen Blutdruckmessgerät.

Benutzerdefinierte Atmung überwachen

1. Wir verwenden eine maßgeschneiderte Atmung überwachen, dass kompatibel gemacht werden mit dem begrenzten Raum und den Zugang zu der Bohrung des Magneten wird. Mehrere kommerzielle Modelle sind ebenfalls erhältlich.
2. Tie ein kleiner Ballon am Ende der Strecke beständig Schlauch in die Sonde zugeführt.
3. Schließen Sie das andere Ende des Schlauchs an einen Druckwandler.
4. Seien Sie sicher, dass die Linie und Ballon sind frei von Luftblasen. Die Blasen werden dämpfen das Signal von der Kompression des Ballons durch die Bewegung der Maus Körper durch Atmung verursacht.

Mauspositionierung in MRS Probe

1. Anesthetize die Maus mit 5% Avertin (0,010 ml / g Körpergewicht).
2. Nach dem Erreichen der operativen Ebene der Anästhesie, positionieren Sie den Mauszeiger in der MRS-Sonde, indem Sie die Maus auf den Rücken der Maus unterstützen. Legen Sie die mit Flüssigkeit gefüllten Ballon auf der Bauchseite der Maus und befestigen Sie mit Maus-Unterstützung Trägern.
3. Position der Maus und Körper zu unterstützen in der MRS-Sonde.
4. Ziehen Sie eine Hinterbein durch die ischämische Manschette und MRS-Spule. Das Bein sollte in der Spule als mu zentriert werdench wie möglich. Diese Anordnung erlaubt die Maus Körper horizontal in eine vertikale Bohrung Magneten positioniert werden (Abbildung 3).
5. Fix Bein statt durch Abkleben Fuß zu starren Träger.
6. Legen Thermoelement subkutan in Hinterlauf außerhalb der Region durch die Spule abgetastet.
7. Befeuchten der Augen mit dem Auge Schmier-Salbe auf die Augen vor dem Austrocknen zu verhindern. Cover Maus Augen und Gesicht zu reiben oder Reizung von der Wand der Sonde zu verhindern.
8. Sonstige Überwachungs-Sonden können hinzugefügt je nach den spezifischen Bedürfnissen des Experiments werden.

Einrichten MRS Experiment

1. Connect Luftstrom zum Heizelement auf dem MRS-Sonde.
2. Setzen Sie die Variable Temperatur-Regeleinheit auf VNMR Software Bein Temperatur bei 35-37 ° C zu halten
3. Tune Spule Frequenz und Impedanz Spiel mit dem Tuning Panel in der MRS-Software für ¹ H und ³¹ P-Resonanzen.
4. Passen shimming Schaltungen, um die Homogenität der B1 Magnetfeld in der Region von Interesse mittels ¹ H-Spektroskopie zu optimieren.
5. Wechseln Sie zu ³¹ P Frequenz des HF-Pulses Breite zu ermitteln, um maximale Signal von einem Free Induction Decay (FID) (90 ° Zeit) zu erhalten.
6. Sammeln hohes Signal-Rausch völlig entspannt Spektren (FRS), um die Verhältnisse von anorganischem Phosphat (P _i) und Phosphokreatin (PCr) zum ATP bestimmen, unter völlig entspannt Bedingungen. Diese Spektren werden gesammelt, indem die 90 °-Zeit mit der Zeit zwischen FID Akquisitionen (TR) von ca. 5x die T ₁ von PCr (20 sek. Bei 7 T). Diese werden für die Quantifizierung von PCR und P _i Ebenen von MR-Spektren verwendet werden.

Ischämische Experiment

1. Eine einfache ischämischen Störung ermöglicht die Bestimmung von Ruhe-und maximale mitochondrialen ATP-Produktion durch die Messung von Veränderungen in Phosphokreatin während und unmittelbar nach Ischämie.
2. Set-up-Array auf mehrere Spektren sammeln mit Hilfe eines 45 ° Pulsbreite (dh 0,5 x 90 ° Zeit) und eine TR von 0.5x der T ₁ (~ 1,5 sek.). Wir sammeln in der Regel 4 FIDs für jeden Spektren (Anzahl der Mittelung (na) = 4 in VNMR Software) für eine zeitliche Auflösung von etwa 6 Sekunden. Diese zeitliche Auflösung ist ausreichend, um genau zu bestimmen, Ruhe-und maximale mitochondrialen ATP-Produktion.
3. Sammeln Sie ruhen Spektren für ca. 5 Minuten.
4. Induce Ischämie durch Aufpumpen der Manschette um 270-300 mmHg für 10-12 Minuten.
5. Lassen Sie die Manschette und sammeln Recovery-Spektren für 5 Minuten.
6. Entfernen Sie die Sonde aus Magneten und der Maus von der Sonde. Lassen Sie die Maus, um aus der Narkose unter geeigneten Bedingungen zu erholen. Experimente können an den folgenden Tagen wiederholt werden. Nach der letzten Spektroskopie Experiment Maus Beinmuskeln werden entfernt und sofort eingespannt Einfrieren in flüssigem N ₂ für die Analyse der ATP-Konzentrationen durch HPLC.

Data Analysis

1. Die Daten werden analysiert offline mit einem von mehreren Spektralanalyse Programme für NMR-Spektren. Unser Labor verwendet in der Regel fit zu Standard ² und jMRUI (http://www.mrui.uab.es/mrui/mrui_Overview.shtml) zur Quantifizierung der Peakflächen.
2. Initial PCr Abbauraten während einer Ischämie sind ein Maß für die mitochondriale ATP-Produktion unter normoxischen Bedingungen wie in mehreren Zeitungen ^3-5 beschrieben. PCr Verwertungsquoten können verwendet werden, um die maximale Kapazität für mitochondriale ATP-Produktion auf dem Ansatz zu bestimmen zuvor beschriebenen ^4,6 sein.

Abbildung 1. In-vivo-MRI-Setup von der Vorderseite des Magneten angesehen Bohrung. Das Setup besteht aus einem HF-Spule, Tier-Erwärmung (oder warmem Wasser Kreislauf-System) und Steigung einzufügen. Alle diese Komponenten sind in einer horizontalen Magneten eingesetzt. Warmes Wasser wird in einem Wasser-Reservoir außerhalb des Magneten Raum erwärmt und in das Tier Erwärmung System über eine Tygon Schlauch (grünes Band). Nach Umlauf in den Zylinder wird Wasser aus der Erwärmung System zurück zum Stausee gezogen, um beheizt werden. Ein Isofluran Rohr-und Vakuumröhrenkollektoren werden verwendet, um Mäuse während der MRT-Untersuchungen zu betäuben.

Abbildung 2 In-vivo-Bilder für eine Nacktmaus mit Xenograft Tumor (Tumor D282) auf dem Rücken (Pfeil) mit unterschiedlichen entspannende Wirkung:. A. T ₁ gewogen Bild (TR / TE = 500/14.2ms). B. T ₂ gewogen Bild (TR / TE = 2s/40ms). Sowohl T ₁ und T _{2-gewichteten} Bilder wurden durch Spin-Echo-Sequenz erworben. C. T _2-Karte mit 4 Sets von Bildern unterschied erworben verarbeitetschiedenen TE-Werte im Bereich von 20 bis 80 ms. D. T ₂ * wog Bild (TR / TE = 180/7.39ms, Flipwinkel = 20 °) durch Gradienten-Echo-Sequenz erworben. Sehfeld von 35 x 35 mm ² ist für alle MR-Bildern.

Abbildung 3. Illustration der Maus in horizontaler Körper-Halter mit Bein positioniert in HF-Spule befestigt.

Abbildung 4. ^In-vivo-31 P-Spektren durch eine Ischämie Reperfusion Zyklus. Die Daten wurden auf einem 7 T vertikale Bohrung Magnet und mit einer 20 Hz-Filter exponentiell erweitert gesammelt. TR = 1, na = 4, alle 20 Spektren aufgezeichnet.

Tabelle 1. Dosierung des Narkosemittels für Maus MRI / MRS.

Tier Spezies	Narkose Agent	Dosis (Mg / kg für injizierbare)	Route
Maus	Isofluran-Gas	4,0% für 2-3 min (Induktion), dann 1,2 bis 1,5% kontinuierlich (Instandhaltung)	Inhalative über Nasenkonus
Maus	Avertin	5%, 10ml/kg Körpergewicht	intraperitoneal (IP)
Maus	Ketamin / Xylazin	100 mg / kg und 10 mg / kg	IP

Tabelle 2. Bild mit Entspannung Gewichtungen

Bild Gewichtung	TR (recycle Verzögerung)	TE (Echozeit)
T1	Short (kürzer als T1)	Short (kürzer als T2)
T2	Lange (3 ~ 5 mal T1)	Long (rund T2)
PD (Protonendichte)	Lange (3 ~ 5 mal T1)	Short (kürzer als T2)

T1: Spin-Gitter-Relaxationszeit (oder longitudinale Relaxation) Zeit
T2: Spin Spin-Relaxationszeit (oder transversale Relaxation) Zeit

Discussion

Die vor der Übernahme Schritte tune / Spiel und Shim sind entscheidend für die hohe räumliche Auflösung und ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) zu erwerben. Es ist auch wichtig, um Tier-Bedingungen mit einem Tier Monitoring-System zu einer stabilen physiologischen Zustand der Tiere zu halten während Signalmittelungen mit humane Behandlung der Tiere zu erfüllen und mögliche Artefakt-Messungen zu verhindern überwachen. Die Verfahren in das Protokoll erklärt werden können modifiziert werden, um zusätzliche Informationen wie Diffusion, Perfusion und Flow Imaging und lokalisierte Spektroskopie in vivo zu erwerben. Alle Tier-Präparate sollten ähnlich sein, wenn ein Verfahren erfordert eine ergänzende Einrichtung. Die Protokolle der MRI und MRS in dieser Studie beschrieben wurden für mehrere Anwendungen, einschließlich Längs-MRT-Untersuchungen für die Entwicklung von Nanosonden Tumoren ⁷ und MRS-Studien für mitochondriale ATP-Produktion ^5,8 Target verwendet wurde. MRI und MRS sind nützliche Techniken zur nichtinvasiven visualisieren Tier anatomische, Entspannung zu ändern oder destruktiv zu überwachen Stoffwechsel. Beide Techniken können als Längs-Monitoring-Verfahren verwendet werden, um oben erwähnten Veränderungen im Laufe der Zeit zu untersuchen. Für MRS bauten wir eine kundenspezifische RF-Sonde, die das Tier in der horizontalen Position in eine vertikale Bohrung Magnet gehalten werden können. So können diese Experimente an jeder vertikalen weiter Bohrung Magnet durchgeführt werden, wie es in den meisten Chemie-Abteilungen gefunden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inova 200 MR scanner/4.7 T	Varian Inc., Agilent		Used for mouse MRI
Inova 300 NMR spectrometer/7 T	Varian Inc., Agilent		Used for MRS of mouse skeletal muscle