No invasiva En Vivo Pequeños Animales MRI y MRS: Procedimientos básicos Experimental

Summary

Este trabajo describe los procedimientos básicos de la no invasiva de animales pequeños MRI y MRS

Abstract

Animal pequeño por Resonancia Magnética (RM) la investigación se ha convertido en un elemento importante de la investigación biomédica moderna debido a su naturaleza no invasiva y la riqueza de la información biológica que ofrece. MR no requiere ningún tipo de radiación ionizante y no invasiva puede proporcionar una mayor resolución y mejor relación señal-ruido en comparación con otras modalidades de tomografía o espectroscópicas. En este protocolo, que se centrará en los pequeños animales la RM y la espectroscopia por RM (MRI / MRS) para adquirir forma no invasiva la relajación ponderada

Protocol

Parte 1: Seguridad Imán

Tanto la RMN como MRS utiliza un campo magnético fuerte que requiere extrema precaución. Por ejemplo, el instrumento T 4.7 que hemos utilizado para el presente trabajo tiene un campo magnético aproximadamente 90.000 veces el campo magnético terrestre. El campo magnético de alta es siempre, incluso cuando el escáner de RM no se utiliza. Cualquier objeto metálico que entra en contacto con un campo magnético de alta será fuerte y rápidamente atraído por el imán. Es muy peligroso si el sujeto experimental o el operador se encuentra en la ruta del proyectil de un objeto metálico, volando hacia el imán. Por lo tanto, el personal que llevan a cabo experimentos de RM debe ser cuidadoso para eliminar todos los objetos metálicos de sus ropas antes de entrar en la proximidad del instrumento ya la vez mantener el entorno libre de tales objetos. Información más detallada sobre la seguridad del imán aparece en la literatura ^una y la siguiente página web: http://www.imrser.org/ . La presencia de material metálico, no sólo puede hacer que el tema de la seguridad antes mencionados, sino interferir con los resultados experimentales mediante la inducción de imágenes / artefactos espectroscópicos. El presente material metálico cerca o dentro del objeto de imagen se puede alterar el campo magnético en las cercanías y así generar artefactos en las imágenes adquiridas o ampliar la línea de ancho del espectro.

En consecuencia, dejar la cartera, llaves, bolígrafos, etc fuera del imán si tratar a los animales para los procedimientos de MR.

Parte 2: En Vivo RM de ratón en una cavidad del imán Horizontal

Preparación de los animales de la RM

1. Todos los procedimientos con animales debe ser aprobado por el Comité Institucional y el empleo Comisión (IACUC) antes de ejecutar cualquier tipo de manejo de animales.
2. Usamos isoflurano vaporizado para anestesiar a los animales para experimentos de resonancia magnética. La anestesia de los animales se puede lograr por otros anestésicos como Avertin (2,2,2-tribromoetanol o TBE) y un cóctel de ketamina y xilazina. Información de dosificación de cada acto anestésico se encuentra en la Tabla 1.
3. Línea de una cámara de inducción con plástico almohadilla absorbente apoyado (azul pad o el mandril). Lugar de un ratón (o varios ratones para multi-imagen del ratón) en la cámara de inducción.
4. Ajustar el caudal del vaporizador isoflurano a 0,8 1,5 L / min. A continuación, ajuste el vaporizador isoflurano al 4% durante unos 2 3 minutos.
5. Después de alcanzar el plano quirúrgico de anestesia (es decir, no hay respuesta pizca dedo del pie), coloque el ratón sobre un titular de los animales con su nariz se inserta en un cono de la nariz (o la máscara). Una inmovilización la cabeza se pueden utilizar para obtener imágenes de la cabeza y un soporte del cuerpo se pueden utilizar para obtener imágenes de cuerpo.
6. Los titulares de los animales se utilizan para evitar el movimiento potencial: hay varios tipos de titulares comercial. Asimismo, el titular de diseño personalizado puede ser fabricado para satisfacer cualquier requisito especial de un sistema experimental. Para el titular de diseño personalizado, asegúrese de usar sólo material no magnético.
7. Durante el período de la imagen, ajustar el medidor de flujo a 0,4 0,8 mL / min y reducir el vaporizador isoflurano a 1,2 al 1,5%. El gas espirado proviene del cono de la nariz del ratón es recogida por una bomba y se retira en un vacío de la casa.
8. Los ojos del animal se mantiene húmedo con una pomada lubricante estéril. El animal se mantuvo a 35-37 ° C durante el experimento dentro de un sistema de circulación de agua caliente. Otros tipos de fuente de calor se puede utilizar como superficies calientes y el aire caliente soplado en la radiofrecuencia (RF) de la bobina.
9. Un sistema de vigilancia de los animales está en el lugar para controlar la temperatura corporal, la respiración / ciclo cardíaco, la respiración y sincronizar / gating cardíaco con la adquisición de la imagen.
10. Una muestra estándar de hecho de agarosa se coloca al lado del animal para monitorear los cambios bruscos de la señal. Esta muestra de agar estándar es especialmente útil para cortes múltiples y múltiples imágenes en tiempo punto. Cuando un cambio de señal inesperada se detecta en una porción de las imágenes obtenidas, el sector con la señal de cambio inesperado puede ser eliminado. Además, su intensidad de la señal puede ser ajustada en base al cambio de la señal del estándar de la muestra durante el análisis post-imagen.
11. Después de colocar de forma segura los animales y los componentes de vigilancia en el soporte de los animales, la posición del titular de los animales en el centro de una bobina de RF.
12. Mover la bobina de RF a la sala de imán y la bobina de RF insertar en el sistema de circulación de agua caliente colocada en el interior del imán. La figura 2 muestra varios componentes de un equipo de resonancia magnética observa desde el frente de la cavidad del imán.

Experimento MRI

1. Ajustar la bobina de RF en la frecuencia de resonancia ^{de 1H} y que coincida con la impedancia característica de la bobina de 50 Ohm con el panel de ajuste en el escáner de RM. Esto es para lograr las condiciones óptimas de recepción de la señal. La mayoría de los escáneres de resonancia magnética humanos no requieren de un proceso independiente de tono / partido, exceptoen los procedimientos de la SRA.
2. Llevar a cabo un proceso de correcciones de compatibilidad con una secuencia de pulsos individuales. Una señal de RM se basa en la homogeneidad del campo magnético del medio ambiente. El proceso de correcciones de compatibilidad permite que el campo magnético en la región de interés para ser lo más homogénea posible. Cada escáner de RM tiene su propia forma de realizar el proceso de correcciones de compatibilidad, incluyendo los procesos automáticos de calce rápido como mapa de gradiente rápido y cuñas.
3. Optimizar el pulso de radiofrecuencia por la maximización de un perfil de imagen tridimensional. RF poderes pulso puede se vista mientras se mantiene la longitud del pulso constante y un tiempo suficiente TR (retardo de reciclaje), que es de aproximadamente 3 - 5 veces la T ₁ de tejido.
4. Adquirir imágenes explorador a lo largo de tres orientaciones ortogonales para crear imágenes axial, coronal y sagital. Una secuencia de adquisición de imágenes rápidas (es decir, el eco de gradiente o secuencia rápida de imágenes eco de espín) puede ser utilizado para adquirir las imágenes scout. Las imágenes obtenidas se utilizan para planificar para la imagen actual con la determinación de los planos de imagen.
5. Cambiar a girar secuencia de eco. Seleccione los parámetros adecuados secuencia: TR (retardo de reciclaje) debe ser de tres a cinco veces el tejido T ₁ para obtener imágenes totalmente relajado, como la densidad de protones o T ₂ imágenes ponderadas. TE (tiempo de eco) es la duración del tiempo entre el primer pulso de RF y el centro de la señal de eco. Un valor de TE puede seleccionar en función de contraste de la imagen que se resumen en la Tabla 2. La figura 2 muestra en vivo las imágenes adquiridas con diferentes efectos de relajación de T _1, T ₂ y T ₂ * de un ratón desnudo con un xenoinjerto de tumor en la espalda.
6. T ₂ mediciones se puede hacer uso de multiecho imágenes o imágenes de eco individual con múltiples valores de TE.
7. A raíz de la experiencia MRI / MRS en vivo, los animales deben ser monitoreados durante el proceso de recuperación. Después de la RM, los animales serán retirados de la bobina de RF y monitoreados para asegurar una recuperación total cuando se volvió a la jaula. La pérdida de calor es rápida en los ratones anestesiados. Mantener a los animales calientes cubriéndolas con gasas o toallas y / o proporcionar una fuente de calor hasta que los animales se recuperan de la anestesia.

Procesamiento de imágenes

1. Revisión de las imágenes adquiridas en la consola de la RM y la transferencia de datos seleccionados a un equipo de post-procesamiento.
2. Por lo general el uso ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) para el análisis de imágenes. El análisis de imagen incluye una escala de imagen / de filtrado, los cálculos de T _1, T ₂ y la difusión, las mediciones de volumen del tumor y la segmentación de los tumores.

Parte 3. En Vivo MRS para el ratón del músculo esquelético en un Miembro Posterior cavidad del imán vertical

La construcción de una Banda para la inducción de isquemia reversible

1. Comience con un pedazo de tubo de PVC que es de aproximadamente 5-7 mm de ancho, con un identificador de 12-15 mm. Perforar un pequeño agujero en la pared de la pieza y el hilo.
2. Corte un pedazo de globo que está abierto en ambos extremos (globos de helio mejor calidad de trabajo). Inserte la pieza a través de la pieza de PVC y envolver la vuelta y termina la cinta junto a la pared exterior de la pieza de PVC.
3. Use retractilado para sellar el globo termina alrededor del tubo. Usted debe tener un brazalete con una sólida muralla exterior y una pared interior inflable.
4. Recorta una zona de abrigo del encogimiento y el balón alrededor de la rosca, teniendo cuidado de dejar un montón de material entre el agujero y el borde de la pieza de PVC. Hilo un trozo de 1,5 cm de metales no ferrosos (cobre, es decir) en el orificio en el PVC. Esto le permite inflar el manguito. Selle el área con 5 minutos de epoxy.
5. Solucionar este manguito en su lugar al lado de la bobina de RF en la sonda de MRS y conectarse a un esfigmomanómetro externo.

Monitor de la respiración personalizado

1. Utilizamos una costumbre controlar la respiración hecho de que está hecho para ser compatible con el espacio restringido y el acceso a la cavidad del imán. Varios modelos comerciales están también disponibles.
2. Ate un pequeño balón hasta el final de la tubería resistente al estiramiento introducen en la sonda.
3. Conecte el otro extremo de la tubería a un transductor de presión.
4. Asegúrese de que la línea y el balón es libre de burbujas de aire. Las burbujas se atenúa la señal de la compresión del globo causada por el movimiento del cuerpo del ratón debido a la respiración.

Posicionamiento del ratón en el MRS de la sonda

1. Anestesiar el ratón con un 5% Avertin (0,010 ml / g de peso corporal).
2. Después de alcanzar el plano quirúrgico de anestesia, la posición del ratón en la sonda MRS situando el ratón sobre la espalda a la ayuda del ratón. Coloque el globo lleno de líquido en la parte ventral del ratón y seguro en su lugar con correas soporte para el ratón.
3. Posición del ratón y el apoyo del cuerpo de la sonda de la SRA.
4. Tire de una extremidad posterior del manguito de isquemia a través de la bobina y el MRS. La pierna debe estar centrado en la bobina como much como sea posible. Este arreglo permite que el cuerpo del ratón para colocar en posición horizontal en vertical cavidad del imán (Figura 3).
5. Fix pata en su lugar con cinta adhesiva pie a un soporte rígido.
6. Lugar termopar por vía subcutánea en extremidades inferiores fuera de la región incluidos en la muestra por la bobina.
7. Humedecer los ojos con el ungüento lubricante ocular para evitar que los ojos se sequen. Cubrir los ojos y la cara del ratón para evitar el roce o la irritación de la pared de la sonda.
8. Otras sondas de monitoreo se pueden añadir en función de las necesidades específicas del experimento.

La creación de Experimento MRS

1. Conecte el flujo de aire a la resistencia de la sonda MRS.
2. Establecer la unidad de control de temperatura variable en software VNMR para mantener la temperatura pierna a 35-37 ° C.
3. Sintonizar la frecuencia y la impedancia de la bobina coincide con el panel de ajuste en el software del MRS, tanto para ¹ H y ³¹ resonancias P.
4. Ajuste calce circuitos para optimizar la homogeneidad del campo magnético B1 en la región de interés mediante ^una espectroscopia de H.
5. Cambiar a la frecuencia ^P-31 para determinar el ancho de pulso de radiofrecuencia para obtener la máxima señal de un deterioro de inducción libre (FID) (90 tiempo °).
6. Recoger la señal de alto a los espectros de ruido totalmente relajado (FRS) para determinar las proporciones de fosfato inorgánico (P _i) y fosfocreatina (PCr) de ATP bajo condiciones totalmente relajado. Estos espectros se recogen con el tiempo 90 ° con el tiempo entre la adquisición de la FID (TR) de aproximadamente 5 veces la T ₁ de PCr (20 seg. A las 7 T). Estos serán utilizados para la cuantificación de los niveles de PCr y P _i de MR espectros.

Experimento isquémica

1. Una perturbación isquémica simple permite la determinación de la producción mitocondrial de reposo y máxima ATP midiendo los cambios en la fosfocreatina durante e inmediatamente después de la isquemia.
2. Set-up matriz para recoger múltiples espectros con un 45 ° de ancho de pulso (es decir, 0,5 x el 90 º tiempo) y un TR de 0,5 veces el T ₁ (~ 1,5 seg.). Por lo general obtener 4 FID para todos los espectros (número promedio de (NA) = 4 en VNMR software) para una resolución de tiempo de aproximadamente 6 segundos. Este tiempo de resolución es suficiente para determinar con precisión la producción mitocondrial de reposo y máxima ATP.
3. Recoge los espectros de descanso para los aproximadamente 5 minutos.
4. Inducir isquemia al inflar el manguito hasta 270-300 mmHg durante 10-12 minutos.
5. Suelte el manguito y recoger los espectros de recuperación de 5 minutos.
6. Retire la sonda de imán y el ratón de la sonda. Deje que el ratón para recuperarse de la anestesia en condiciones adecuadas. Los experimentos se pueden repetir en los días siguientes. Después de los músculos de la espectroscopia de final de la pierna experimento del ratón se retiran y se congelan inmediatamente sujeta-en N ₂ líquido para el análisis de las concentraciones de ATP por HPLC.

Análisis de Datos

1. Se analizan los datos fuera de línea con uno de los varios programas de análisis espectral de los espectros de RMN. Nuestro laboratorio utiliza normalmente en condiciones de nivel ² y jMRUI (http://www.mrui.uab.es/mrui/mrui_Overview.shtml) para la cuantificación de las áreas de pico.
2. Inicial de las tasas de degradación de PCr durante la isquemia es una medida de la producción de ATP mitocondrial en condiciones normoxic como se describe en varios documentos ^5.3. PCr las tasas de recuperación se puede utilizar para determinar la capacidad máxima de producción de ATP mitocondrial basado en el método descrito previamente ^4,6.

Figura 1. En la configuración de resonancia magnética in vivo se ve desde la parte frontal de la cavidad del imán. La configuración consta de una bobina de RF, sistema de calefacción de los animales (o el sistema de circulación de agua caliente) e insertar gradiente. Todos estos componentes se insertan en un imán horizontal. El agua caliente se calienta en un depósito de agua fuera de la sala del imán y se introduce en el sistema de calentamiento de los animales a través de un tubo de Tygon (cinta verde). Después de circular en el cilindro, el agua se extrae del sistema de calentamiento de nuevo al depósito de agua a calentar. Un tubo de isoflurano y el tubo de vacío se utilizan para anestesiar a los ratones durante los experimentos de resonancia magnética.

Figura 2 En las imágenes in vivo de un ratón desnudo con xenoinjerto de tumor (tumor D282) en su parte posterior (flecha) con efectos relajantes diferentes:. A. T ₁ peso la imagen (TR / TE = 500/14.2ms). B. T ₂ pesa la imagen (TR / TE = 2s/40ms). Tanto T ₁ y T ₂ imágenes ponderadas fueron adquiridas por la secuencia de eco de espín. C. T mapa ₂ tratados con 4 series de imágenes obtenidas por el DIFdiferentes valores de TE de 20 a 80 ms. D. T ₂ * imagen pesa (TR / TE = 180/7.39ms, ángulo de inclinación = 20 grados), adquiridos por la secuencia de eco de gradiente. Campo de visión de 35 x 35 mm ² es para todas las imágenes de RM.

Figura 3. Ilustración de ratón situado en el soporte horizontal del cuerpo con la pierna asegurado en la bobina de RF.

Figura 4. In vivo espectros ³¹ P a través de un ciclo de isquemia reperfusión. Los datos fueron recolectados en un imán de 7 T y la línea vertical de diámetro ampliado con un filtro de 20 Hz exponencial. TR = 1, na = 4, todos los espectros de 20 se trazan.

Tabla 1. Dosis de anestesia para el ratón MRI / MRS.

Animal Especies	Anestésico Agente	Dosis (Mg / kg para los inyectables)	Ruta
Ratón	Gas isoflurano	4,0% durante 2-3 min (inducción), y luego 1,2 a 1,5% de forma continua (de mantenimiento)	Inhalado a través de cono de la nariz
Ratón	Avertin	5%, el peso del cuerpo 10ml/kg	intraperitoneal (IP)
Ratón	La ketamina / xilacina	100 mg / kg y 10 mg / kg	IP

Tabla 2. La imagen con las ponderaciones de relajación

La imagen de ponderación	TR (retardo de reciclaje)	TE (tiempo de eco)
T1	Corto (menos de T1)	Corto (menos de T2)
T2	De largo (3 a 5 veces T1)	De largo (alrededor de T2)
PD (densidad de protones)	De largo (3 a 5 veces T1)	Corto (menos de T2)

T1: relajación spin red (o la relajación longitudinal) el tiempo
T2: relajación spin spin (o relajación transversal) el tiempo

Discussion

Los pasos previos a la adquisición de tono / partido y cuñas son críticos para la adquisición de alta resolución espacial y una elevada relación señal-ruido (SNR). También es importante monitorear las condiciones de policía con un sistema de vigilancia animal para mantener un estado fisiológico estable de los animales durante la adquisición de la señal para cumplir con el manejo humanitario de los animales y evitar que las mediciones de artefactos potenciales. Los procedimientos que se explican en el protocolo puede ser modificado para obtener información adicional, incluyendo imágenes de difusión, perfusión y el flujo y la espectroscopia localizada en vivo. Todos los preparativos de los animales debe ser similar a menos que un procedimiento requiere una configuración adicional. Los protocolos de la RM y la SRA se describe en este estudio se han utilizado para diversas aplicaciones incluyendo longitudinal estudios de resonancia magnética para el desarrollo de nanosondas atacar tumores de ⁷ y MRS estudios de producción de ATP mitocondrial ^5,8. MRI y MRS son técnicas útiles para visualizar no invasiva de animales anatómica cambio, la relajación o para controlar el metabolismo de forma no destructiva. Ambas técnicas se pueden utilizar como los procedimientos de seguimiento longitudinal para examinar mencionados cambios en el tiempo. Para MRS hemos construido una costumbre de la sonda de radiofrecuencia que permite que el animal se mantenga en posición horizontal en una cavidad del imán vertical. Por lo tanto, estos experimentos se pueden realizar en cualquier vertical de grueso calibre imán, tal como se encuentra en la mayoría de los departamentos de química.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inova 200 MR scanner/4.7 T	Varian Inc., Agilent		Used for mouse MRI
Inova 300 NMR spectrometer/7 T	Varian Inc., Agilent		Used for MRS of mouse skeletal muscle