Non invasive In Vivo Petits animaux IRM et SRM: base des procédures expérimentales

Summary

Ce travail décrit les procédures de base de non-invasive du petit animal par IRM et SRM

Abstract

Petits animaux par Résonance Magnétique (IRM) de recherche a émergé comme un élément important de la recherche biomédicale moderne, en raison de sa nature non invasive et la richesse des informations biologiques qu'il fournit. MR ne requiert aucune radiation ionisante et ne peut fournir de façon non invasive de plus haute résolution et un meilleur rapport signal-bruit en comparaison à d'autres modalités tomographiques ou spectroscopiques. Dans ce protocole, nous allons nous concentrer sur de petits animaux IRM et spectroscopie par résonance magnétique (IRM / SRM) pour acquérir de manière non invasive la relaxation pondérés

Protocol

Partie 1: Sécurité Aimant

L'IRM et SRM utiliser un champ magnétique fort qui exige une extrême prudence. Par exemple, l'instrument 4,7 T que nous avons utilisé pour le présent travail a un champ magnétique d'environ 90 000 fois le champ magnétique terrestre. Le champ magnétique élevé est toujours sur la même lorsque le scanner IRM n'est pas utilisé. Tout objet métallique qui entre en contact avec un tel champ magnétique élevé sera fortement et rapidement attirée par l'aimant. Il est extrêmement dangereux si un sujet d'expérimentation ou de l'exploitant se trouve dans le chemin projectile de voler un objet métallique dans l'aimant. Par conséquent, le personnel qui effectuent des expériences MR devrait veiller à enlever tout objet métallique de leurs vêtements avant d'entrer dans la proximité de l'instrument et aussi de maintenir l'environnement exempt de tels objets. Des informations plus détaillées sur la sécurité aimant apparaît dans la littérature ¹ et la page Web suivante: http://www.imrser.org/ . La présence d'un matériau métallique peuvent non seulement causer des problèmes de sécurité mentionnés ci-dessus, mais interfèrent avec les résultats expérimentaux en induisant l'imagerie / spectroscopie artefacts. Le présent matériau métallique à proximité ou dans l'objet d'imagerie peuvent modifier le champ magnétique dans le voisinage et ainsi de générer des artefacts sur les images acquises ou d'élargir la ligne de largeur de spectres.

Par conséquent, laissez portefeuille, clés, stylos, etc extérieur de l'aimant si vous manipulez des animaux pour les procédures de MR.

Partie 2: In Vivo IRM de la souris dans un aimant horizontal Alésage

Préparation des animaux pour l'IRM

1. Toutes les procédures d'animaux devraient être approuvés par le soin des animaux institutionnels et le comité d'utilisation (IACUC) avant d'exécuter tout type de manipulation des animaux.
2. Nous utilisons vaporisé isoflurane pour anesthésier les animaux pour des expériences d'IRM. L'anesthésie des animaux peut être atteint par d'autres anesthésiques tels que Avertin (2,2,2-tribromoéthanol ou TBE) et un cocktail de kétamine et de xylazine. Informations sur le dosage de chaque anesthésie se trouve dans le tableau 1.
3. Ligne d'une chambre d'induction avec du plastique tampon absorbant soutenu (bleu pad ou mandrin). Placez une souris (ou plusieurs souris multi-souris imagerie) dans la chambre de l'induction.
4. Ajuster le débitmètre du vaporisateur isoflurane à 0,8 à 1,5 L / min. Réglez ensuite le vaporisateur isoflurane à 4% pendant 2 3 minutes.
5. Après avoir atteint le plan chirurgical de l'anesthésie (ie pas de réponse pincement de l'orteil), placez la souris sur un support animal avec son nez inséré dans un cône de nez (ou masque). Un dispositif de contention de tête peut être utilisé pour l'imagerie tête et un porte-corps peuvent être utilisés pour l'imagerie du corps.
6. Les détenteurs d'animaux sont utilisés pour empêcher le mouvement potentiel: il existe plusieurs types de détenteurs commerciales. En outre, un support sur mesure conçus peuvent être fabriqués pour accommoder les exigences particulières d'une installation expérimentale. Pour un support sur mesure conçus, assurez-vous d'utiliser uniquement matériau non magnétique.
7. Pendant la période d'imagerie, d'ajuster le débitmètre à 0,4 0,8 mL / min et de réduire le vaporisateur isoflurane à 1,2 à 1,5%. Le gaz expiré venant du cône de nez de la souris est recueillie par une pompe et enlevé dans un vide en interne.
8. Les yeux de l'animal sera maintenu humide avec une pommade lubrifiante oculaires stériles. L'animal sera maintenu à 35-37 ° C pendant l'expérience au sein d'un système de circulation d'eau chaude. D'autres types de source de chaleur peuvent être utilisés tels que des coussinets chauffants et l'air chaud soufflé dans la radiofréquence (RF) de la bobine.
9. Un système de surveillance des animaux est en place pour surveiller la température du corps, la respiration / cycle cardiaque, et de synchroniser la respiration / synchronisation cardiaque avec des acquisitions d'image.
10. Un échantillon standard en agarose est placé à côté de l'animal pour surveiller les changements du signal brutal. Cet échantillon de gélose standard est particulièrement utile pour les multi-coupes et de l'imagerie multi-points-temps. Quand un changement de signal inattendu est détecté dans une tranche à partir des images acquises, la tranche avec le changement de signal inattendu peut être éliminé. En outre, ses intensités du signal peut être ajustée en fonction du changement du signal de l'échantillon standard pendant la post-analyse d'image.
11. Après solidement plaçant l'animal et de composants de surveillance sur le détenteur des animaux, la position du titulaire des animaux au centre d'une bobine RF.
12. Déplacer l'antenne RF à la salle de l'aimant et insérer la bobine RF dans le système de circulation d'eau chaude placée à l'intérieur de l'aimant. La figure 2 montre plusieurs composants d'un scanner IRM observées par l'avant de l'aimant.

Expérience IRM

1. Accordez la bobine RF à la fréquence de résonance de ¹ H et correspondre à l'impédance caractéristique de la bobine à 50 Ohm en utilisant le panneau de réglage dans le scanner IRM. Ceci est d'atteindre des conditions optimales de réception du signal. La plupart des scanners IRM humains n'ont pas besoin d'un processus distinct de la hauteur / match, saufdans les procédures de MRS.
2. Mener un processus de calage à l'aide d'une séquence d'impulsion unique. Un signal MR s'appuie sur l'homogénéité du champ magnétique de l'environnement. Le processus de calage permet au champ magnétique dans la région d'intérêt à être aussi homogène que possible. Chaque scanner IRM a sa propre façon d'exécuter le processus de calage, y compris les processus de calage automatique rapide tels que carte de calage rapide et dégradé.
3. Optimiser l'impulsion RF en maximisant un profil image tridimensionnelle. RF puissances d'impulsion peut être vêtue tout en gardant la longueur de l'impulsion constante et une longue TR assez (délai de recycler) qui est d'environ 3 - 5x T ₁ de tissu.
4. Acquérir scouts images le long de trois orientations orthogonales de créer axiale, les images coronales et sagittales. Une séquence d'images acquisition rapide (écho de gradient soit rapide ou séquence d'imagerie écho de spin) peut être utilisé pour acquérir les images de scouts. Les images acquises seront utilisées pour planifier pour l'imagerie réelle avec détermination des plans d'imagerie.
5. Changer de tourner la séquence d'écho. Sélectionnez les paramètres bonne séquence: TR (retard recycler) devrait être de trois à cinq fois le tissu T ₁ d'acquérir des images parfaitement détendus tels que la densité de protons ou T ₂ images pondérées. TE (temps d'écho) est la durée de temps entre la première impulsion RF et le centre du signal d'écho. Une valeur de TE peuvent être sélectionnés en fonction de contraste d'image tels que résumés dans le Tableau 2. La figure 2 montre des images in vivo acquis avec effets de relaxation différents de T _1, T ₂ et T ₂ * pour une souris nude avec une tumeur xénogreffe sur son dos.
6. T ₂ mesures peut être fait soit en utilisant l'imagerie ou l'imagerie multiecho seul écho aux valeurs de TE multiples.
7. Suite à l'expérience d'IRM / SRM in vivo, les animaux doivent être surveillés tout au long du processus de récupération. Après l'IRM, les animaux seront pris hors de la bobine RF et surveillés pour assurer la récupération complète lors du retour à la cage. La perte de chaleur est rapide chez la souris anesthésiée. Gardez les animaux au chaud en les couvrant avec des tampons de gaze ou de serviettes de toilette et / ou en fournissant une source de chaleur jusqu'à ce que les animaux sont récupérés de l'anesthésie.

Traitement d'images

1. Examen images acquises sur la console MR et le transfert des données sélectionnées à un ordinateur de post-traitement.
2. Nous utilisons généralement ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) pour l'analyse des images. L'analyse d'image inclut échelle de l'image / filtrage, calculs de T _1, T ₂ et la diffusion, les mesures de volume de la tumeur et la segmentation des tumeurs.

Partie 3. In Vivo MRS pour souris membres postérieurs du muscle squelettique dans un aimant alésage vertical

Construction de manchette pour induire une ischémie réversible

1. Commencez avec un morceau de tuyau en PVC qui est environ 5-7 mm de large avec un ID de 12-15 mm. Percez un petit trou dans le mur de cette pièce et le fil.
2. Coupez un morceau de ballon de sorte qu'il est ouvert aux deux extrémités (ballons d'hélium de qualité fonctionnent mieux). Insérez cette pièce à travers la pièce en PVC et envelopper retourne et bande se termine ainsi sur le mur extérieur de la pièce en PVC.
3. Utilisez film rétractable pour sceller le ballon termine autour du tube. Vous devriez avoir un brassard avec une paroi solide extérieure et une paroi gonflable intérieure.
4. Découpez une superficie de pellicule rétractable et le ballon autour du trou fileté, en prenant soin de laisser suffisamment de matériau entre le trou et le bord de la pièce en PVC. Enfilez un morceau de 1,5 cm de métaux non ferreux (cuivre par exemple) dans le trou dans le PVC. Cela vous permet de gonfler le brassard. Sceau de la zone avec de l'époxy 5 minutes.
5. Fixer cette manchette en place à côté de la bobine RF dans la sonde MRS et se connecter à un sphygmomanomètre à l'extérieur.

Surveiller la respiration personnalisé

1. Nous utilisons un moniteur de respiration sur mesure qui est faite pour être compatible avec l'espace restreint et accès à l'alésage de l'aimant. Plusieurs modèles commerciaux sont également disponibles.
2. Attachez un petit ballon à la fin du tube résistant à étirer introduit dans la sonde.
3. Branchez l'autre extrémité du tuyau à un capteur de pression.
4. Soyez sûr de la ligne et le ballon est libre de bulles d'air. Les bulles vont atténuer le signal de la compression du ballon causé par le mouvement du corps de la souris à cause de la respiration.

Positionnement de la souris dans MRS Sonde

1. Anesthésier la souris avec 5% Avertin (0,010 poids corporel ml / g).
2. Après avoir atteint le plan chirurgical de l'anesthésie, la position de la souris dans la sonde MRS en plaçant la souris sur son dos sur le support de la souris. Placez le ballon rempli de liquide sur la face ventrale de la souris et fixer en place avec des sangles de soutien de la souris.
3. Positionnez votre pointeur et le soutien du corps dans la sonde MRS.
4. Tirez une patte arrière à travers la coiffe des ischémique et la bobine MRS. La jambe doit être centré dans la bobine comme much que possible. Cet arrangement permet au corps de la souris pour être placé horizontalement dans un aimant alésage vertical (figure 3).
5. Fixer la jambe en place par coller le pied au support rigide.
6. Placer un thermocouple sous-cutanée dans la région en dehors des membres postérieurs échantillonnés par la bobine.
7. Humidifier les yeux avec la pommade lubrifiante yeux pour éviter les yeux de séchage. Couvrir les yeux de souris et le visage pour éviter les frottements ou l'irritation de la paroi de la sonde.
8. Sondes de surveillance supplémentaires peuvent être ajoutés selon les besoins spécifiques de l'expérience.

Mise en place Expérience MRS

1. Connectez-air à l'élément chauffant sur la sonde MRS.
2. Réglez l'unité de température variable de contrôle sur le logiciel VNMR pour maintenir la température jambes à 35-37 ° C.
3. La fréquence et l'impédance serpentin Tune match de l'aide du panneau de réglage dans le logiciel SRM pour les deux ¹ H et ³¹ P résonances.
4. Ajustez calage circuits afin d'optimiser l'homogénéité du champ magnétique B1 dans la région d'intérêt en utilisant ^une spectroscopie H.
5. Commutateur à ³¹ fréquences P pour déterminer la largeur des impulsions RF à rendement maximal du signal d'un déclin d'induction libre (FID) (90 fois °).
6. Recueillir signal haute aux spectres du bruit complètement détendu (FRS) pour déterminer les ratios de phosphate inorganique (P _i) et phosphocréatine (PCr) à l'ATP dans des conditions totalement détendu. Ces spectres sont recueillies à l'aide du temps à 90 ° avec le temps entre les acquisitions FID (TR) d'environ 5x le T ₁ de la PCR (20 sec. À 7 T). Ceux-ci seront utilisées pour la quantification des niveaux _I et P PCr de MR spectres.

Expérience ischémique

1. Une perturbation simples ischémique permet la détermination de repos et maximale la production mitochondriale d'ATP par la mesure des changements dans phosphocréatine pendant et immédiatement après l'ischémie.
2. Largeur d'impulsion Mise en place de tableau pour collecter des spectres multiples en utilisant un 45 ° (soit 0,5 x le 90 ° temps) et un TR de 0,5 x le T ₁ (~ 1,5 sec.). En général, nous recueillons 4 FID pour chaque spectres (nombre de moyenne (na) = 4 dans VNMR logiciels) pour une résolution de temps d'environ 6 secondes. Cette résolution temporelle est suffisante pour déterminer avec précision le repos et maximale de production d'ATP mitochondriale.
3. Recueillir des spectres de repos pendant environ 5 minutes.
4. Induire une ischémie en gonflant le brassard à 270-300 mmHg pendant 10-12 minutes.
5. Relâchez le brassard et collecter des spectres de récupération pendant 5 minutes.
6. Retirer la sonde de l'aimant et la souris de la sonde. Laissez la souris pour remettre de l'anesthésie dans des conditions appropriées. Les expériences peuvent être répétées les jours suivants. Après les muscles dernière jambe de spectroscopie expérimentation de la souris sont retirées et immédiatement gel-serré dans un liquide N ₂ pour l'analyse des concentrations d'ATP par HPLC.

Analyse des données

1. Les données sont analysées en utilisant une ligne de plusieurs programmes de l'analyse spectrale des spectres RMN. Notre laboratoire utilise généralement apte à la norme ² et jMRUI (http://www.mrui.uab.es/mrui/mrui_Overview.shtml) pour quantifier les domaines de pointe.
2. Initiale des taux répartition PCr durant l'ischémie sont une mesure de la production mitochondriale d'ATP dans des conditions normoxique comme décrit dans plusieurs articles ^3-5. PCr taux de récupération peut être utilisé pour déterminer la capacité maximale pour la production d'ATP mitochondriale basée sur l'approche décrite précédemment ^4,6.

Figure 1. Dans la configuration IRM in vivo vus de l'avant de l'aimant. La configuration comprend une bobine RF, système de réchauffement d'origine animale (ou tiède système de circulation d'eau) et d'insérer dégradé. Tous ces composants sont insérés dans un aimant horizontal. L'eau chaude est chauffée dans un réservoir d'eau en dehors de la salle de l'aimant et introduit dans le système de réchauffement des animaux par le biais d'un tube Tygon (ruban vert). Après avoir circulé dans le cylindre, l'eau est tirée du système de réchauffement de retour au réservoir d'eau à chauffer. Un tube isoflurane et à tubes sous vide sont utilisés pour anesthésier les souris au cours d'expériences d'IRM.

Figure 2 images in vivo pour une souris nude avec une tumeur xénogreffe (D282 tumeur) sur son dos (flèche) avec différents effets de relaxation:. A. T ₁ pesé image (TR / TE = 500/14.2ms). B. T ₂ pesé image (TR / TE = 2s/40ms). Les deux ₂ T ₁ et T images pondérées ont été acquises par la séquence d'écho de spin. C. T ₂ carte traitées avec 4 séries d'images acquises par différentsdifférentes valeurs de TE allant de 20 à 80 ms. D. T ₂ * l'image pesé (TR / TE = 180/7.39ms, angle de bascule = 20 degrés) acquis par séquence en écho de gradient. Champ de vision de 35 x 35 mm ² est pour toutes les images IRM.

Figure 3. Illustration de la souris positionnée dans le porte-corps horizontal avec la jambe sécurisé dans la bobine RF.

Figure 4. In vivo spectres ³¹ P par un cycle ischémie-reperfusion. Les données ont été collectées sur un aimant de 7 T alésage vertical et ligne élargi avec un filtre 20 Hz exponentielle. TR = 1, NA = 4, tous les spectres 20 sont tracées.

Tableau 1. Posologie des anesthésiques pour la souris IRM / SRM.

Des animaux Espèces	Anesthésie Agent	Dose (Mg / kg pour les produits injectables)	Route
Souris	De gaz isoflurane	4,0% pendant 2-3 min (induction), puis 1,2 à 1,5% en continu (d'entretien)	Inhalés par le nez conique
Souris	Avertin	5%, le poids corporel 10ml/kg	intrapéritonéale (IP)
Souris	Kétamine / xylazine	100 mg / kg et 10 mg / kg	IP

Tableau 2. Image avec les pondérations de relaxation

Pondération image	TR (retard recycler)	TE (écho du temps)
T1	Court (plus court que T1)	Court (plus court que T2)
T2	Longue (3 ~ 5 fois T1)	Longue (environ T2)
PD (densité de protons)	Longue (3 ~ 5 fois T1)	Court (plus court que T2)

T 1: relaxation du réseau de spin (ou de relaxation longitudinale) du temps
T2: relaxation spin spin (ou de relaxation transversale) du temps

Discussion

Les étapes de pré-acquisition de syntoniser / match et calage sont essentiels pour acquérir une haute résolution spatiale et un rapport signal sur bruit (SNR). Il est également important de surveiller les conditions des animaux avec un système de surveillance des animaux pour maintenir un état physiologique stable pour les animaux lors d'acquisitions du signal de se conformer à la manipulation sans cruauté des animaux et d'empêcher toute mesure potentielle artéfactuelle. Les procédures décrites dans le protocole peut être modifié pour acquérir des informations supplémentaires, y compris l'imagerie de diffusion, de perfusion et de débit et de spectroscopie localisée in vivo. Tous les préparatifs des animaux devrait être similaire à moins qu'une procédure nécessite une configuration supplémentaire. Les protocoles d'IRM et SRM décrits dans cette étude ont été utilisés pour plusieurs applications, y compris des études longitudinales IRM pour le développement de nanosondes pour cibler les tumeurs et les études de ⁷ SRM pour la production d'ATP mitochondriale ^5,8. IRM et SRM sont des techniques utiles aux non-invasive de visualiser les changements anatomiques animales détente, ou pour suivre le métabolisme non destructive. Les deux techniques peuvent être utilisées comme procédures de suivi longitudinales pour examiner les changements mentionnés ci-dessus au fil du temps. Pour MRS, nous avons construit une sonde personnalisée RF qui permet à l'animal d'être maintenu en position horizontale dans un aimant alésage vertical. Ainsi, ces expériences peuvent être réalisées sur tout verticale wide-bore aimant, comme on en trouve dans les départements les plus chimie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inova 200 MR scanner/4.7 T	Varian Inc., Agilent		Used for mouse MRI
Inova 300 NMR spectrometer/7 T	Varian Inc., Agilent		Used for MRS of mouse skeletal muscle