Noninvasiv In Vivo Small Animal MRI och MRS: Grundläggande experimentell procedurer

Summary

Detta arbete beskriver grundläggande procedurer för icke-invasiv små djur MRI och MRS

Abstract

Små djur magnetresonans (MR) forskning har vuxit fram som en viktig del av modern biomedicinsk forskning på grund av dess icke-invasiva karaktär och den rika biologiska information som tillhandahålls. MR kräver ingen joniserande strålning och kan noninvasivt ge högre upplösning och bättre signal-brus-förhållande i jämförelse med andra tomografiska eller spektroskopiska metoder. I detta protokoll kommer vi att fokusera på små djur MR och MR spektroskopi (MR / MRS) till noninvasivt förvärva avslappning vägda

Protocol

Del 1: Magnet Säkerhet

Både MR och MRS använder ett starkt magnetfält som kräver extrem försiktighet. Till exempel har 4,7 T instrument som vi använde för detta arbete ett magnetfält ungefär 90.000 gånger jordens magnetfält. Den höga magnetfält är alltid på även när MR skannern inte används. Varje metallföremål som kommer i kontakt med en så hög magnetfält kommer att vara starkt och snabbt attraheras av magneten. Det är mycket farligt om en försöksperson eller operatören ligger i projektilen vägen för ett metallföremål flyga in i magneten. Därför bör personal som bedriver MR experiment vara noga med att avlägsna alla metallföremål från sina kläder innan de kommer in i närheten av instrumentet och även behålla den omgivande miljön vara fri från sådana föremål. Mer detaljerad information om magneten säkerhet framstår i litteraturen ¹ och följande webbsida: http://www.imrser.org/ . Förekomsten av metalliskt material kan inte bara orsaka nämnda säkerheten fråga men stör experimentella resultat genom att inducera bildhantering / spektroskopiska artefakter. Den metalliskt material nuvarande nära eller inuti avbildning objektet kan förändra det magnetiska fältet i närheten och så genererar artefakter på förvärvade bilder eller bredda line-bredd spektra.

Därför lämnar plånbok, nycklar, pennor mm utanför magneten om du hanterar djur för MR förfaranden.

Del 2: In Vivo MRT av Mouse i en horisontell Bore magnet

Animal Förberedelse för MR

1. Alla djur förfarandena bör godkännas av den institutionella djurvård och använda kommitté (IACUC) före utför alla typer av djurhantering.
2. Vi använder förångas isofluran att söva djur för MR experiment. Anestesi av djur kan uppnås genom andra anestetika såsom AVERTIN (2,2,2-tribromoethanol eller TBE) och en cocktail av ketamin och xylazin. Doseringsanvisningar för varje bedövningsmedel finns i tabell 1.
3. Linje en induktion kammare med plastklätt absorberande dyna (blå pad eller chuck). Placera en mus (eller flera möss för multi-mus imaging) i induktion kammaren.
4. Justera flödesmätare av isofluran Vaporizer till 0,8 1,5 L / min. Justera sedan isofluran Vaporizer till 4% i ca 2 3 minuter.
5. Efter att ha nått den kirurgiska plan anestesi (dvs. ingen tå nypa respons), placera musen på ett djur hållare med nosen in i en noskon (eller mask). Ett huvud restrainer kan användas för huvud avbildning och en kropp hållare kan användas för kroppen avbildning.
6. Djurens ägare används för att förhindra potentiella rörelse: Det finns flera typer av kommersiella innehavare. Dessutom kan en specialdesignad innehavaren att tillverkas för att tillgodose särskilda behov av en experimentell inställning. För en färdig konstruerad hållare, se till att endast använda omagnetiskt material.
7. Under avbildning period anpassa flödesmätaren till 0,4 0,8 ml / min och minska isofluran Vaporizer till 1,2 1,5%. Det utgångna gas som kommer från musen noskon samlas in av en pump och tas in i ett internt vakuum.
8. Ögonen på djuret kommer att hållas fuktig med en steril blick smörjande salva. Djuret kommer att hållas vid 35-37 ° C under experimentet i en cirkulation av varmvatten-system. Andra typer av värmekälla kan användas som uppvärmd kuddar och varm luft blåses in i radiofrekvent (RF) spole.
9. Ett djur övervakningssystem för att övervaka kroppstemperatur, andning / hjärt-cykel, och synkronisera andning / hjärta slussning med bild förvärv.
10. En standard prov gjord av agaros placeras bredvid djuret för att övervaka abrupta signalen förändras. Denna standard agar provet är särskilt användbart för multi-slice och multi-tidpunkt avbildning. När en oväntad signal förändringar upptäcks i en bit från de förvärvade bilder kan segmentet med oväntade signalen förändras elimineras. Dessutom kan dess signal intensitet justeras baserat på signalen förändringen av standarden provet under efter bildanalys.
11. Efter säkert placera djuret och komponenter övervakning på djuret hållaren, placera djuret hållaren i mitten av en RF-spole.
12. Flytta RF-spole till magnet rummet och sätt in RF-spole i det varma vattnet cirkulationssystem placeras inuti magneten. Figur 2 visar flera komponenter i en magnetkamera som observerats från framsidan av magneten bar.

MRT Experiment

1. Ställ in RF-spole till ^en H resonansfrekvens och matcha den karakteristiska impedans på spolen till 50 ohm med tuning panelen i MR skanner. Detta för att uppnå optimala förhållanden för mottagning. De flesta mänskliga MR skannrar kräver inte en separat process i samklang / match, utomav MRS förfaranden.
2. Genomför ett mellanlägg process med en enda puls sekvens. En MR-signal bygger på miljöområdet magnetfält homogenitet. Den mellanlägg Processen gör att magnetfältet i regionen av intresse så homogen som möjligt. Varje MR skanner har sitt eget sätt att utföra mellanlägg, inklusive automatisk snabb mellanlägg processer som snabbt karta och lutning mellanlägg.
3. Optimera RF-pulsen genom att maximera en endimensionell bild profil. RF-puls makter kan ställa i ordning samtidigt som pulslängden konstant och en tillräckligt länge TR (återvinna fördröjning) som är ungefär 3 - 5x T ₁ av vävnad.
4. Förvärva scout bilder längs tre ortogonala riktlinjer för att skapa axial, koronalt och sagittal bilder. En snabb bild förvärv sekvens (dvs gradient eko eller snabb spin eko bildbehandling sekvens) kan användas för att förvärva scout bilder. Den förvärvade bilderna kommer att användas för att planera för faktisk avbildning med bestämning av bildbehandling plan.
5. Byt till spin eko sekvens. Välj rätt ordning parametrar: TR (återvinner fördröjning) bör vara tre till fem gånger vävnaden T ₁ att förvärva helt avkopplad bilder som proton täthet eller T ₂ viktade bilder. TE (eko tid) är tidslängden mellan första RF-puls och centrum ekosignalen. En TE värde kan väljas beroende på bildens kontrast som sammanfattas i Tabell 2. Figur 2 visar in vivo-bilder som förvärvats med olika avslappning effekterna av T _1, T ₂ och T ₂ * för en naken mus med en xenograft tumör på ryggen.
6. T ₂ mätningar kan göras antingen med hjälp av multiecho avbildning eller enstaka eko avbildning med flera TE-värden.
7. Efter MRT / MRS in vivo-experiment bör djuren övervakas under hela återhämtningsprocessen. Efter MR, måste djuren tas ur RF-spole och övervakas för att garantera fullständig återhämtning då tillbaka till buren. Värmeförluster är snabb i sövda möss. Håll djuren varma genom att täcka dem med gasbinda kuddar eller handdukar och / eller tillhandahålla en värmekälla till dess djuren har återhämtat sig från narkos.

Bildbehandling

1. Översyn förvärvade bilder på MR-konsolen och överföra utvalda data till en efterbehandling dator.
2. Vi använder vanligtvis ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) för att analysera bilder. Bilden analysen ingår bildskalning / filtrering, beräkningar av T _1, T ₂ och diffusion, tumör mätningar volym och segmentering av tumörer.

Del 3. In Vivo MRS för Mouse bakdelen skelettmuskulaturen i en vertikal Bore magnet

Konstruktion av Manschett för att framkalla reversibel Ischemi

1. Börja med en bit PVC-rör som är ca 5-7 mm bred med ett id på 12-15 mm. Borra ett litet hål genom väggen för denna bit och tråd.
2. Klipp en bit av ballongen så det är öppet i båda ändar (helium kvalitet ballonger fungerar bäst). Sätt denna pjäs genom PVC-bit och linda tillbaka runt och tejpa ihop ändarna på utsidan väggen i PVC-pjäs.
3. Använd krympplast för att täta ballongen slutar runt röret. Du bör ha en manschett med en solid yttervägg och en uppblåsbar innervägg.
4. Klipp ut ett område med krympplast och ballong runt det gängade hålet, var noga med att lämna gott om material mellan hålet och i kanten av PVC-pjäs. Tråd en 1,5 cm bit av icke-järnmetaller (dvs mässing) i hålet på PVC. Detta gör att du kan blåsa upp manschetten. Täta område med 5 minuters epoxi.
5. Åtgärda detta manschetten på plats bredvid den RF-spole i MRS sond och ansluta till en extern blodtrycksmätare.

Anpassad respiration Övervaka

1. Vi använder en specialtillverkad andning bildskärm som är gjord för att vara förenlig med begränsat utrymme och tillgång till hålet i magneten. Flera kommersiella modeller finns också.
2. Knyt en liten ballong till slutet av sträckan resistenta slangen matas in i sonden.
3. Anslut den andra änden av slangen till en tryckgivare.
4. Var noga med linjen och ballongen är fria från luftbubblor. Bubblorna kommer att dämpa signalen från kompression av ballongen orsakad av musens rörelser kroppen på grund av andning.

Mus Positionering av MRS Probe

1. Bedöva musen med 5% Avertin (0,010 ml / g kroppsvikt).
2. Efter att ha nått den kirurgiska plan anestesi, placera musen i MRS sonden genom att placera musen på rygg på musen stöd. Placera vätskefylld ballong på den ventrala sidan av musen och säkra på plats med band mus-stöd.
3. Placera musen och kroppen stöd i MRS sonden.
4. Dra ett bakdelen genom ischemisk manschetten och MRS spole. Benet ska vara centrerad i spolen som much som möjligt. Detta arrangemang gör att musen kroppen placeras horisontellt i en vertikal hål magnet (Figur 3).
5. Fixera benet på plats genom att tejpa foten för att fast stöd.
6. Placera termoelement subkutant i bakbenen utanför regionen provtagits av spolen.
7. Fukta ögonen med ögat smörjande salva för att förhindra att ögonen från att torka. Täck mus ögon och ansikte för att förhindra att gnida eller irritation från väggen av sonden.
8. Andra övervaknings-givare kan läggas till beroende på de särskilda behov av försöket.

Ställa in MRS Experiment

1. Anslut luftflödet till värmeelement på MRS sonden.
2. Ställ den rörliga enheten temperatur på VNMR programvara för att hålla benet temperatur på 35-37 ° C.
3. Tune spole frekvens och matcha impedans med tuning panelen i MRS programvara för både ¹ H och ³¹ resonanser P.
4. Justera mellanlägg kretsar för att optimera homogenitet B1 magnetfält i regionen av intresse med hjälp av ^en H spektroskopi.
5. Växla till ³¹ P-frekvens för att bestämma RF pulsbredden för att ge maximal signal från en fri induktion sönderfall (FID) (90 ° tid).
6. Samla hög signal-brus helt avkopplad spektra (FRS) för att bestämma proportionerna av oorganiskt fosfat (P _i) och phosphocreatine (PCR) till ATP i helt avkopplad förhållanden. Dessa spektra samlas med 90 ° tid med tid mellan FID förvärv (TR) på cirka 5 gånger i T ₁ av PCR (20 sek. Vid 7 T). Dessa kommer att användas för kvantifiering av PCR och P _i nivåer från MR spektra.

Ischemisk Experiment

1. En enkel ischemisk störningsräkning möjliggör bestämning av vila och maximal mitokondrie ATP produktionen genom att mäta förändringar i phosphocreatine under och omedelbart efter ischemi.
2. Set-up array för att samla in flera spektra med en 45 ° pulsbredd (dvs 0,5 x 90 ° tid) och en TR av 0,5 x T ₁ (~ 1,5 sek.). Vi samlar vanligen 4 FIDs för varje spektra (antal snitt (na) = 4 i VNMR programvara) för en tidsupplösning på ca 6 sekunder. Denna gång upplösningen är tillräcklig för att exakt fastställa vila och maximal mitokondriella ATP-produktion.
3. Samla vila spektra i ca 5 minuter.
4. Framkalla ischemi genom att blåsa upp manschetten till 270-300 mm Hg i 10-12 minuter.
5. Släpp manschetten och samla återhämtning spektra i 5 minuter.
6. Ta bort sonden från magneten och mus från sonden. Låt musen för att återhämta sig från anestesi under lämpliga förhållanden. Experiment kan upprepas vid efterföljande dagar. Efter det slutliga musen spektroskopi experiment benmuskler tas bort och omedelbart frysa fastklämd i flytande N ₂ för analys av ATP-koncentrationen genom HPLC.

Data Analysis

1. Data analyseras inte med hjälp av en av flera spektralanalys program för NMR-spektra. Vårt laboratorium använder vanligtvis passar till standard ² och jMRUI (http://www.mrui.uab.es/mrui/mrui_Overview.shtml) för att kvantifiera toppytor.
2. Inledande PCr uppdelning priser under ischemi är ett mått på den mitokondriella ATP produktion under normoxic villkor som beskrivs i flera tidningar ^3-5. PCr återvinningsgraderna kan användas för att bestämma den maximala kapaciteten för mitokondriella ATP-produktion baserad på den metod som beskrivs tidigare ^4,6.

Figur 1. In vivo MR inställning sett från framsidan av magneten bar. Installationsprogrammet består av en RF-spole, djur uppvärmningen system (eller varmt vatten cirkulationssystem) och lutning sätt. Alla dessa komponenter är infogat i ett horisontell magnet. Varmt vatten värms i en vattenreservoar utanför magneten rummet och förs in i djuret uppvärmningen systemet genom en Tygon rör (grön tejp). Efter cirkulerar i cylindern, är vatten dras från uppvärmningen systemet tillbaka till vattenbehållaren som ska värmas. En isofluran rör och sugrör används för att söva möss under MR experiment.

Figur 2 In vivo bilder för en naken mus med xenograft tumör (D282 tumör) på rygg (pil) med olika avkoppling effekter:. A. T ₁ vägde bild (TR / TE = 500/14.2ms). B. T ₂ vägde bild (TR / TE = 2s/40ms). Både T ₁ och T ₂ viktade bilder förvärvades av spinn eko sekvens. C. T ₂ kartan bearbetas med 4 uppsättningar bilder förvärvades av olikaolika TE värden från 20 till 80 ms. D. T ₂ * vägde bild (TR / TE = 180/7.39ms, vända vinkel = 20 grader) förvärvades av gradient eko sekvens. Synfält på 35 x 35 mm ² är till för alla MR-bilder.

Figur 3. Illustration av musen placeras i horisontella kroppen hållare med benet fast i RF-spole.

Figur 4. In ^vivo-31 P-spektra genom ett ischemi reperfusion cykel. Data samlades in på en 7 T vertikalt hål magnet och linje breddas med en 20 Hz exponentiellt filter. TR = 1, NA = 4, var 20 spektra plottas.

Tabell 1. Dosering av bedövningsmedel för mus MRT / MRS.

Animal Arter	Narkos Agent	Dos (Mg / kg för injicerbara)	Rutt
Mus	Isofluran gas	4,0% i 2-3 min (induktion), sedan 1,2 till 1,5% kontinuerligt (underhåll)	Inhalerat via noskon
Mus	Avertin	5%, 10ml/kg kroppsvikt	intraperitoneal (IP)
Mus	Ketamin / Xylazine	100 mg / kg och 10 mg / kg	IP

Tabell 2. Bild med avslappning viktning

Bild Viktning	TR (återvinna fördröjning)	TE (eko tid)
T1	Kort (kortare än T1)	Kort (kortare än T2)
T2	Lång (3 ~ 5 gånger T1)	Lång (runt T2)
PD (proton täthet)	Lång (3 ~ 5 gånger T1)	Kort (kortare än T2)

T1: spinn gitter avslappning (eller längsgående avslappning) tid
T2: spinn spinn (eller tvärgående avslappning) tid

Discussion

Den före förvärvet steg TUNE / match och mellanlägg är avgörande för att få hög rumslig upplösning och ett högt signal-brus-förhållande (SNR). Det är också viktigt att övervaka djurens med ett djur övervakningssystem för att upprätthålla en stabil fysiologiska tillstånd för djur under signal förvärv att följa human djurhantering och för att förhindra eventuella artefaktuella mätningar. De förfaranden som beskrivs i protokollet kan ändras för att skaffa ytterligare information bl.a. spridning, perfusion och flöde bildbehandling och lokaliserade spektroskopi in vivo. Alla djur preparat bör vara densamma om inte ett förfarande kräver en extra installation. Protokollen av MRI och MRS som beskrivs i denna studie har använts för flera olika tillämpningar, inklusive longitudinella MR-studier för utveckling av nanoprobes att rikta tumörer ⁷ och MRS studier för mitokondriella ATP produktionen ^5,8. MRI och MRS är användbara tekniker för att noninvasivt visualisera djur anatomiska, avkoppling ändra eller icke-förstörande övervaka metabolism. Båda teknikerna kan användas som longitudinella övervakningsförfaranden för att undersöka ovan nämnda förändringar över tid. För MRS vi byggde en egen RF-sond som tillåter djuret att hållas i horisontellt läge i en vertikal bar magnet. Således kan dessa experiment utföras på alla vertikala breda bar magnet, som finns i de flesta kemi avdelningar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inova 200 MR scanner/4.7 T	Varian Inc., Agilent		Used for mouse MRI
Inova 300 NMR spectrometer/7 T	Varian Inc., Agilent		Used for MRS of mouse skeletal muscle