无创在体内小动物的MRI和MRS：基本实验程序

Summary

这项工作描述无创性的小动物MRI和MRS的基本程序

Abstract

小动物磁共振（MR）的研究已成为现代生物医学研究，由于其非侵入性的性质和它提供了丰富的生物信息的重要元素。议员并不需要任何电离辐射，非侵入性，可以提供更高的分辨率和更好的信号噪声比在其他断层或光谱方式相比。在这个协议中，我们将重点放在小动物磁共振成像和磁共振波谱（MRI / MRS）的非侵入性收购放松加权

Protocol

第1部分：安全磁铁

MRI和MRS使用一个强大的磁场，需要格外小心。例如，仪器，我们目前的工作中使用的4.7 T磁场，地球磁场的约90000倍。高磁场始终是即使不被使用的磁共振扫描仪。任何金属物体接触到这样一个高磁场的强烈和迅速将磁铁吸引。这是极其危险的，如果一个实验题目或运营商是在位于飞入磁铁的金属对象的弹丸路径。因此，进行致辞实验的人员应小心删除任何金属物体进入仪器接近前从他们的服装，并保持周围的环境，这样的对象。磁铁安全的更详细的信息出现在^文献 1以下网页： ​​http://www.imrser.org/ 。金属材料的存在，不仅可以造成上述安全问题，但诱导影像/光谱文物与实验结果的干扰。在附近成像物体附近或内部的金属材料存在可以改变磁场，使获得的图像生成的工件或扩大的谱线宽度。

因此，外磁铁离开钱包，钥匙，钢笔等，如果你处理的动物致辞程序。

第2部分： 在小鼠体内磁共振成像在水平孔磁铁

动物的准备MRI

1. 所有动物的程序应经体制的动物护理和使用委员会（IACUC）前执行任何类型的动物处理。
2. 我们使用汽化异氟醚麻醉用于核磁共振成像实验的动物。 avertin（2,2,2 - tribromoethanol或简称TBE）和氯胺酮和甲苯噻嗪的鸡尾酒，如其他麻醉药，麻醉动物可以实现。每个麻醉剂用量的信息是发现于表1。
3. 线塑料支持的吸水垫（蓝色的垫子或卡盘）的感应室。将鼠标（或多个小鼠多鼠标成像），在诱导室。
4. 调整异氟醚蒸发器流量计0.8 1.5 L / min的。然后调整至4％的异氟醚蒸发器，约2 3分钟。
5. 达到手术的麻醉平面（即没有脚趾捏响应）后，地方上的动物持有人的鼠标，它的鼻子插入一个鼻锥（或面罩）。头限位可用于头成像的机构持有人可使用全身显像。
6. 动物持有人使用，以防止潜在的运动：有几种类型的商业持有人。此外，定制设计的持有人可以编造的实验装置，以适应任何特殊要求。定制设计的持有人，确保只使用非磁性物质。
7. 成像期间，调整流量计0.4 0.8毫升/分钟，减少到1.2〜1.5％的异氟醚蒸发器。过期的天然气来自鼠标鼻锥是由泵收集到一个内部真空中删除。
8. 动物的眼睛保持湿润无菌眼润滑软膏。将保持在35-37 ° C，在一个温暖的循环水系统内的实验动物。可用于其他类型的热源，如加热垫，暖空气吹入的射频（RF）线圈。
9. 动物监测系统是监测体温，呼吸/心脏周期，并与影像收购同步呼吸/心脏门控到位。
10. 琼脂糖标准样品被放在旁边的动物监察突然信号变化。本标准琼脂样品是多层面和多时间点成像特别有用。当一个意外的信号变化是从采集到的图像切片检测的，意外的信号变化的切片可以消除的。此外，在后的图像分析标准样品的信号变化的基础上，其信号强度可以调整。
11. 安全放在动物的人，动物和监视组件后，动物的人，在一个射频线圈的中心位置。
12. 移动射频线圈，磁铁的房间，并插入到系统内的磁铁放置温水循环射频线圈。图2显示，从磁铁的前面观察核磁共振成像扫描仪的几个组件孔。

磁共振成像实验

1. 调谐射频线圈的共振频率的^{1 H}和线圈的特性阻抗相匹配到50欧姆的磁共振扫描仪中使用调整面板。这是为了达到最佳的信号接收条件。大多数人类的核磁共振成像扫描仪不需要一个单独的进程中调整/匹配除刘健程序。
2. 进行一个匀场的过程中，使用单脉冲序列。 MR信号依赖于环境的磁场均匀。垫补过程使该地区的利益，尽可能同质的磁场。每个磁共振扫描仪，有它自己的方式来执行的垫补过程中，包括自动快速快速地图和梯度垫补垫补过程。
3. 优化射频脉冲，通过最大化的一个三维图像轮廓。射频脉冲的权力，可以排列，同时保持恒定的脉冲长度和一个足够长的TR（回收拖延），大约是3 - 5倍的组织_T 1 。
4. 沿三个正交方向创建轴向，冠状面和矢状面图像采集球探图像。一个快速的图像采集序列（即梯度回波或快速自旋回波成像序列）可以用来获得球探图像。采集到的图像将被用于计划与成像平面的决心的实际成像。
5. 更改自旋回波序列。选择适当的序列参数：TR（回收拖延）应三至五倍的_组织 T 1，以获得充分的放松，如质子密度_或 T 2加权图像图像。 TE（回波时间）之间的首个射频脉冲和回波信号的中心的持续时间。可以选择的TE​​值取决于图像的对比度，如表2总结。图2显示了与T _{1，T 2}和T ₂ *不同的松弛效应获得了一个在它的后面的移植瘤的裸鼠体内图像。
6. T ₂的测量可以使用multiecho成像或单一回波成像与多个TE值。
7. MRI / MRS在体内实验后，应监测动物的整个恢复过程中。磁共振成像后，将取出的动物射频线圈和监测，以确保完全恢复时返回到笼。在麻醉小鼠的快速热损失。保持温暖的动物，其中包括用纱布垫或毛巾和/或提供热源，直到动物从麻醉中恢复。

图像处理中的

1. 回顾收购致辞控制台上的图像和选定的数据传输到后处理的计算机。
2. 我们通常使用ImageJ（ http://rsbweb.nih.gov/ij/分析图像）。图像分析，包括图像缩放/过滤，计算T _1，T 2和扩散，肿瘤体积测量及肿瘤的分割。

第3部分。在一个垂直的玻尔磁体内小鼠后肢骨骼肌刘健

袖口建设诱发可逆性缺血

1. 用PVC管件，约5-7毫米，宽12-15毫米的ID开始。钻了一个小洞，通过墙上的这块和线程。
2. 剪下一块的气球，所以它是开放两端（氦的质量气球最好的工作）。通过PVC片插入件和包装左右带子两端外墙上的PVC片。
3. 使用收缩包装密封气球两端管周围。你应该有一个具有坚实的外墙和一个充气的内壁袖口。
4. 剪下的面积收缩包装和气球的螺纹孔周围，照顾孔的PVC片的边缘之间留下大量的材料。线程A非铁金属（如铜）1.5厘米成孔在PVC片。这可以让你充气袖带。 5分钟的环氧密封区。
5. 修正了在袖口旁边的射频线圈在刘健探头并连接到一个外部的血压计。

自定义呼吸监视器

1. 我们使用一个自定义的呼吸监测是要受限制的空间和访问磁铁的孔兼容。一些商业模式也可提供。
2. 一个小气球，以铁的耐拉伸管馈入探针年底。
3. 连接管压力传感器的另一端。
4. 确保线路和气球的气泡。气泡会衰减信号压缩鼠标身体因呼吸运动造成的气球。

鼠标定位在刘健探头

1. 5％Avertin（0.010毫升/克体重）麻醉鼠标。
2. 达到手术的麻醉平面后，位置刘健探头鼠标，鼠标支持鼠标放置在它的后面。鼠标放在腹部充满液体的气球，并确保在代替鼠标支持带。
3. 刘健探头位置鼠标和身体的支持。
4. 拉出之一后肢缺血的袖口和刘健线圈。腿应集中在线圈亩CH尽可能。这种安排使鼠体定位在一个垂直的孔磁铁的水平（图3）。
5. 修正盘带脚刚性支持腿到位。
6. 在区域外的线圈采样的后肢皮下放置热电偶。
7. 浸湿的眼睛，用眼润滑软膏，以防止眼睛干燥。包括鼠标的眼睛和脸从墙上探头，以防止摩擦或刺激。
8. 根据实验的具体需求，可以添加其他监控探头。

设置刘健实验

1. 刘健探头连接气流加热元件。
2. 设置可变温度控制单元VNMR软件腿温度保持在35-37 ° C。
3. 调整线圈的频率和匹配阻抗在^{1 H}和^31个P共振刘健软件的使用调整面板。
4. 调整垫片电路优化B1磁场的均匀性^，在使用1 H光谱利益的地区。
5. 切换到^31个P频率来确定射频脉冲宽度产量最大的信号从一个自由感应衰减（FID）（90 °）。
6. 收集高信号噪音完全放松谱（FRS），以确定完全放松的条件下无机磷的_比率 （P I）和磷酸肌酸（PCr）的ATP。这些光谱收集，使用90 °的时间与时间之间的FID收购（TR）PCR _的 T 1（20秒7 T）的约5倍。这些将被用于定量PCR和P _我先生谱水平。

缺血性实验

1. 一个简单的缺血性扰动允许的休息，最大的线粒体ATP生产的决心，通过测量在磷酸变化和紧接缺血。
2. 设置阵列来收集多光谱，采用45 °的脉冲宽度（即0.5 × 90 °的时间）和0.5X的TR的_T 1（1〜1.5秒） 。我们通常收集4 FID的每一个约6秒的时间分辨率光谱（VNMR软件的平均数目（NA）= 4）。这个时间分辨率是足够准确地确定休息和最大的线粒体ATP生产。
3. 收集约5分钟的休息光谱。
4. 诱导缺血10-12分钟到270-300毫米汞柱袖带充气。
5. 松开袖口和恢复谱收集5分钟。
6. 取出磁体和探头，探头鼠标。让鼠标在适当的条件下从麻醉中恢复。在随后的日子里，可反复实验。经过最后的光谱实验小鼠腿部肌肉在液态_氮将被删除，立即冻结钳位ATP浓度的高效液相色谱分析。

数据分析

1. 数据进行离线分析使用NMR谱的谱分析的几个方案之一。我们的实验室通常使用合适的标准²和jMRUI（http://www.mrui.uab.es/mrui/mrui_Overview.shtml）量化峰面积。
2. PCR初步的故障率在缺血常氧条件下线粒体ATP生产^的措施，在3-5几篇论文描述。 PCR的回收率可用于确定线粒体ATP生产的最大容量的基础上的^方法 ，以前4,6介绍。

从磁铁的前端看在体内MRI设置图1。孔。设置包括一个射频线圈，动物变暖系统（或温循环水系统）和梯度插入。所有这些组件将被插入到一个水平磁铁。温水中加热磁体室外面的一个蓄水池，通过聚乙烯管（绿色磁带）的动物变暖系统介绍。在汽缸内循环后，水是从拉暖系统水库被加热。一个异氟醚管和真空集热管是用来麻醉在核磁共振实验小鼠。

图2在体内与裸小鼠移植瘤在它的后面不同的松弛效应（箭头）（D282肿瘤）图像_：A. T 1。称重形象“（TR / TE = 500/14.2ms ）。 B. T ₂重形象“（TR / TE = 2s/40ms） 。这两种T ₁和T ₂加权图像获得自旋回波序列。 C. T ₂的地图处理与图像DIF收购的4套ferent TE值从20到80毫秒。 D. T ₂ *称重（TR / TE = 180/7.39ms，翻转角= 20度）收购梯度回波序列。 35 × 35毫米²场是所有MR图像。

图3。插图鼠标定位在水平身体与腿架固定在射频线圈。

图4 ^31个P光谱在体内通过一个缺血再灌注周期。数据被收集在一个7 T垂直孔磁铁和20赫兹指数滤波器扩大线。 TR = 1，NA = 4，每20谱绘制。

表1。鼠标MRI /刘健麻醉剂用量。

动物 物种	麻醉剂 代理	剂量 （毫克/公斤为注射）	路线
鼠标	异氟醚气体	2-3分钟（感应）的4.0％，1.2至1.5％连续（维护）	吸入通过鼻锥
鼠标	Avertin	5％，10ml/kg体重	腹腔（IP）
鼠标	氯胺酮/甲苯​​噻嗪	100毫克/公斤和10毫克/公斤	知识产权

表2。放松比重的图像

图像加权	TR（回收延迟）	TE（回波时间）
T1	短（T1短）	短（短于T2）
T2	长（3〜5倍的T1）	长（约T2）
PD（质子密度）	长（3〜5倍的T1）	短（短于T2）

T1：自旋晶格弛豫时间（或纵向弛豫）
T2：自旋自旋弛豫时间（或横向弛豫）

Discussion

调整/匹配和垫补收购前的步骤是至关重​​要的，以获得高空间分辨率和高的信号噪声比（SNR）。同样重要的是监测动物与动物监测系统，以保持在一个稳定的信号采集的生理状态的动物，符合人性化的动物处理，以防止任何潜在的artifactual测量条件。在协议解释的程序，可以进行修改，以获取更多的信息，包括在体内的扩散，灌注和血流成像和本地化光谱。所有的动物准备工作应该是相似的，除非一个过程，需要补充设置。已被用于多个应用程序，包括开发目标^肿瘤 7和刘健研究线粒体ATP ^生产 5,8的纳米探针的纵向MRI研究MRI和MRS在这项研究中所描述的协议。 MRI和MRS是有用的技术，以非侵入性可视化动物解剖，放宽变更或无损监测新陈代谢。这两种技术可用于纵向监测程序审查上述变化，随着时间的推移。太太，我们建立了一个自定义的射频探针，使动物保持在一个垂直的孔磁铁的水平的位置。因此，这些实验可以在任何垂直的大口径磁铁，如发现大多数化学系。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inova 200 MR scanner/4.7 T	Varian Inc., Agilent		Used for mouse MRI
Inova 300 NMR spectrometer/7 T	Varian Inc., Agilent		Used for MRS of mouse skeletal muscle