פולשנית In vivo קטנים בעלי חיים MRI ו MRS: הפרוצדורות בסיסי

Summary

עבודה זו מתארת ​​את הנהלים הבסיסיים של פולשנית חיה MRI קטן MRS

Abstract

בעלי חיים קטנים תהודה מגנטית (MR) מחקר התפתחה כמרכיב חשוב של מחקר ביו המודרנית בשל האופי שלה לא פולשנית ואת העושר של מידע ביולוגי שהיא מספקת. MR אינו דורש שום קרינה מייננת ויכול noninvasively לספק רזולוציה גבוהה יותר וטוב יותר אות לרעש יחס בהשוואה טומוגרפית אחרים או שיטות ספקטרוסקופיות. בפרוטוקול זה, נתמקד קטן חיה MR הדמיה MR ספקטרוסקופיה (MRI / MRS) כדי לרכוש noninvasively הרפיה משוקלל

Protocol

חלק 1: בטיחות מגנט

שניהם MRI ו MRS להשתמש בשדה מגנטי חזק הדורש זהירות רבה. לדוגמה, מכשיר 4.7 T כי השתמשנו לעבודה הנוכחית יש שדה מגנטי בערך 90,000 פעמים את השדה המגנטי הארץ. שדה מגנטי גבוה תמיד, גם כאשר על הסורק MR לא נמצא בשימוש. כל חפץ מתכתי כי בא במגע עם שדה מגנטי גבוה כגון יימשכו בעוצמה ובמהירות על ידי המגנט. זה מסוכן מאוד אם נושא מפעיל ניסיוני או נמצא בנתיב את הטיל של חפץ מתכתי עף לתוך המגנט. לפיכך, אדם אשר עורכים ניסויים MR צריך להיות זהיר כדי להסיר כל חפצי מתכת מן בגדיהם לפני כניסתם הקרבה של המכשיר וגם לשמור על סביבתו ללא עצמים כאלה. מידע מפורט יותר על בטיחות מגנט מופיע בספרות ¹ ו דף האינטרנט הבאים: http://www.imrser.org/ . הנוכחות של חומר מתכתי לא יכול רק לגרום לבעיית הבטיחות הנ"ל אבל להפריע תוצאות הניסוי על ידי גרימת הדמיה / חפצים ספקטרוסקופיות. נוכח חומר מתכתי ליד או בתוך אובייקט הדמיה יכול לשנות את השדה המגנטי בקרבת וכך ליצור חפצים על תמונות שנרכשו או להרחיב את קו הרוחב של הספקטרום.

לפיכך, לעזוב, ארנק מפתחות, עטים, וכו 'מחוץ המגנט אם לטפל בבעלי חיים נהלים MR.

חלק 2: in vivo MRI של עכבר מגנט משעמם אופקי

בעלי חיים הכנה MRI

1. כל הנהלים בעל חיים צריך להיות מאושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדה להשתמש (IACUC) לפני ביצוע כל סוגי הטיפול בבעלי חיים.
2. אנו משתמשים מתאדה isoflurane להרדים בעלי חיים לניסויים MRI. הרדמה של בעלי חיים ניתן להשיג על ידי חומרי הרדמה אחרים כגון Avertin (2,2,2-tribromoethanol או TBE) וכן קוקטייל של קטמין ו xylazine. מידע מינון של כל הרדמה נמצא בטבלה 1.
3. הקו אינדוקציה קאמרית עם משטח הפלסטיק סופג מגובה (כחול כרית או לזרוק). המקום עכבר (או עכברים מרובים עבור הדמיה רב העכבר) בחדר אינדוקציה.
4. התאם את flowmeter של מאדה isoflurane ל 0.8 1.5 L / min. ואז להתאים את מאדה isoflurane 4% למשך כ 2 3 דקות.
5. לאחר שהגיע המטוס של הרדמה כירורגית (כלומר ללא תגובה קמצוץ הבוהן), הצב את העכבר על בעל חיה עם האף שלו מוכנס לתוך חרוט האף (או מסכה). עוצר את הראש יכולה לשמש הדמיה ראש בעל גוף יכול לשמש הדמיה הגוף.
6. בעלי חיים משמשים כדי למנוע תנועה פוטנציאל: ישנם מספר סוגים של בעלי מסחרי. כמו כן, בעל מתוכנן המותאם אישית יכול להיות מפוברק כדי להכיל את כל דרישות מיוחדות של התקנה ניסיונית. עבור בעל מעוצב אישית, הקפד להשתמש רק חומר מגנטיים.
7. במהלך התקופה הדמיה, כדי להתאים את flowmeter 0.4 0.8 mL / min ולהפחית את מאדה isoflurane ל -1.5% 1.2. הגז פג מגיע קונוס האף עכבר נאסף על ידי משאבה והוציאו לתוך ואקום in-house.
8. העיניים של החיה יישמר לח עם משחה עין סטרילי סיכה. החיה יישמר ב 35-37 מעלות צלזיוס במהלך הניסוי בתוך מערכת מים חמים במחזור. סוגים אחרים של מקור החום יכול לשמש כגון כריות מחוממת אוויר חם לתוך פוצצו לסליל גלי רדיו (RF).
9. מערכת ניטור החיה נמצא במקום כדי לפקח על חום הגוף, הנשימה / מחזור לב, לסנכרן את הנשימה / gating לב עם רכישות התמונה.
10. מדגם סטנדרטי עשוי agarose ממוקם ליד החיה לפקח לשנות אות פתאומי. זה מדגם אגר הסטנדרטי הוא שימושי במיוחד עבור פלח רב ורב הזמן הדמיה נקודה. כאשר לא צפוי שינוי אות מזוהה פרוסת מהתמונות רכשה, פרוסה עם לשנות את האות צפויה אפשר לחסל. כמו כן, עוצמות האות שלה יכול להיות מותאם על בסיס לשנות את אות של המדגם תקן במהלך ניתוח שלאחר התמונה.
11. לאחר מאובטח הצבת בעלי חיים רכיבים ניטור על בעל חיים, בעל עמדה חיה במרכז סליל RF.
12. הזז את סליל RF לחדר מגנט והכנס את סליל RF לתוך מערכת מחזור מים חמים ממוקמים בתוך המגנט. תרשים 2 מציג את מספר מרכיבים של סורק MRI נצפתה מהחזית של המגנט לשעמם.

ניסוי ה-MRI

1. כוון את הסליל RF לתדר H ¹ תהודה ולהתאים את עכבה אופיינית של סליל כדי 50 אוהם באמצעות לוח כוונון בתוך סורק MRI. זה כדי להשיג תנאים מיטביים של הקבלה האות. סורקי MRI האדם רוב אינם דורשים תהליך נפרד של מנגינה / משחק חוץבנהלים MRS.
2. ניהול תהליך shimming באמצעות רצף הדופק יחיד. אות MR מסתמך על ההומוגניות בתחום איכות הסביבה המגנטי. תהליך shimming מאפשר את השדה המגנטי באזור עניין להיות הומוגנית ככל האפשר. כל סורק MR יש דרך משלו כדי לבצע את תהליך shimming, כולל תהליכים אוטומטיים shimming מהיר כמו מפה מהר shimming הדרגתי.
3. מטב את הדופק RF ידי מיקסום פרופיל אחד ממדי התמונה. RF סמכויות הדופק יכול להיות ערוכים תוך שמירה על אורך הפולס קבועים TR מספיק זמן (עיכוב למחזר) כי הוא כ 3 - 5x-T ₁ של רקמת גוף.
4. רוכשת את הסקאוט תמונות בשלושה כיוונים אורתוגונליים כדי ליצור צירית, תמונות העטרה ועל sagittal. תמונת רצף מהיר הרכישה (הד כלומר שיפוע או סיבוב מהיר הד רצף הדמיה) ניתן להשתמש כדי לרכוש את התמונות הסקאוט. התמונות שנרכשו ישמשו תוכנית הדמיה בפועל בנחישות של מטוסים הדמיה.
5. שנה לטוות רצף הד. בחירת הפרמטרים בסדר הנכון: TR (עיכוב למחזר) יש שלוש עד חמש פעמים את הרקמה T ₁ לרכוש תמונות רגוע לחלוטין כגון צפיפות פרוטון או T ₂ תמונות משוקלל. TE (זמן הד) הוא משך הזמן בין הדופק RF הראשון במרכז אות הד. ערך TE ניתן לבחור בהתאם ניגודיות התמונה כפי שמסוכם בטבלה 2. איור 2 מראה תמונות vivo רכשה עם תופעות שונות של הרפיה T _1, T ₂ ו-T ₂ * עבור עכבר בעירום עם גידול xenograft על גבו.
6. T ₂ מדידות ניתן לעשות זאת גם באמצעות multiecho הדמיה או הדמיה הד בודד עם מספר רב של ערכים TE.
7. בעקבות הניסוי MRI / MRS in vivo, בעלי חיים צריכים להיות במעקב לאורך כל תהליך ההחלמה. לאחר MR הדמיה, החיות יילקחו מתוך סליל ה-RF ו פיקוח על מנת להבטיח החלמה מלאה כאשר חזר הכלוב. אובדן חום מהיר בעכברים מורדמים. שמור על בעלי החיים החם על ידי כיסוי אותם עם פדי גזה או מגבות ו / או מתן מקור החום, עד בעלי חיים התאושש מן ההרדמה.

עיבוד תמונה

1. סקירה רכשה תמונות על הקונסולה MR והעברת נתונים נבחרים למחשב שלאחר עיבוד.
2. אנו משתמשים בדרך כלל ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) לניתוח תמונות. ניתוח התמונה הכוללת דרוג התמונה / סינון, חישובים של T _1, T ₂ ו דיפוזיה, מדידות נפח הגידול פילוח של גידולים.

חלק 3. In vivo גברת עבור שרירים Hindlimb עכבר השלד מגנט משעמם אנכי

בניית קאף על גרימת איסכמיה הפיכה

1. התחל עם חתיכת צינור PVC כי הוא 5-7 מ"מ כ רחב עם id של 12-15 מ"מ. לקדוח חור קטן באמצעות קיר זה חתיכת חוט.
2. חותכים פיסת בלון כך הוא פתוח בשני הקצוות (בלוני הליום איכות העבודה הטובה ביותר). הכנס זה חתיכת דרך היצירה PVC ו לעטוף חזרה סביב קלטת הקצוות על הקיר החיצוני של היצירה PVC.
3. השתמש לכווץ לעטוף לאטום את הבלון מסתיים סביב הצינור. אתה צריך השרוול בקיר החיצוני מוצק הקיר הפנימי מתנפחים.
4. לגזור על שטח של לעטוף בלון להתכווץ סביב החור מושחל, מקפיד להשאיר שפע של חומר בין החור לבין קצה חתיכת PVC. נושא פיסת 1.5 ס"מ של מתכת אל ברזליות (כלומר פליז) לתוך החור ב-PVC. זה מאפשר לך לנפח את השרוול. חותם את האזור עם אפוקסי 5 דקות.
5. תקן זה השרוול במקום ליד סליל ה-RF של החללית גברת ולהתחבר מד לחץ דם חיצוני.

נשימה מותאם אישית Monitor

1. אנו משתמשים לפקח אישית הנשימה עשה כי הוא עשוי להיות תואם במרחב מוגבל וגישה נשא של המגנט. מספר מודלים מסחריים זמינים גם.
2. עניבה בלון קטן לסוף צינורות עמידים למתוח מוזן לתוך החללית.
3. חבר את הקצה השני של הצינור אל מתמר הלחץ.
4. הקפד הקו בלון הן ללא בועות אוויר. בועות יהיה להחליש את האות דחיסה של הבלון נגרמת על ידי התנועה של הגוף העכבר עקב הנשימה.

עכבר מיצוב ב MRS Probe

1. להרדים את העכבר עם Avertin 5% (0.010 מ"ל / גרם משקל גוף).
2. לאחר שהגיע המטוס כירורגית של הרדמה, מקם את העכבר בדיקה גברת ידי הצבת העכבר על גבו על תמיכה בעכבר. מניחים את הבלון מלאות נוזל בצד הגחוני של העכבר ומאובטח במקום עם רצועות תמיכה בעכבר.
3. מקם את העכבר ותמיכה לגוף לחקור את גברת.
4. במשיכה אחת hindlimb דרך השרוול איסכמית סליל MRS. הרגל צריכה להיות מרוכז בתוך הסליל כמו muפרק האפשרי. הסדר זה מאפשר לגוף העכבר כדי למקם אופקית מגנט משעמם אנכי (איור 3).
5. תקן הרגל במקום על ידי מקליטה הרגל לתמוך נוקשה.
6. המקום תרמי תת עורי ב hindlimb מחוץ לאזור שנדגמו על ידי הסליל.
7. להרטיב את העיניים עם משחה את העין סיכה כדי למנוע את העיניים מפני התייבשות. כיסוי העיניים עכבר והפנים כדי למנוע שפשוף או גירוי מהקיר של החללית.
8. בדיקות ניטור אחרים ניתן להוסיף בהתאם לצרכים הספציפיים של הניסוי.

הגדרת ניסוי MRS

1. חבר זרימת האוויר על גוף החימום על החללית MRS.
2. הגדר את משתנה הטמפרטורה יחידת בקרה על תוכנה VNMR לשמירה על חום הרגל ב 35-37 ° C.
3. Tune סליל התדירות עכבה התאמה באמצעות לוח כוונון בתוכנה גברת הן ¹ H ו ³¹ תהודות P.
4. התאם shimming מעגלים כדי לייעל את ההומוגניות של השדה המגנטי B1 באזור ריבית באמצעות ספקטרוסקופיית H ^1.
5. החלף לתדר ³¹ P כדי לקבוע את רוחב פולס RF להניב איתות מרבית ריקבון one אינדוקציה בחינם (FID) (90 פעם °).
6. איסוף האות גבוה ספקטרום רעש רגוע לחלוטין (FRS) כדי לקבוע את היחס של פוספט אנאורגני (P _i) phosphocreatine (PCR) ל-ATP בתנאים רגועים לחלוטין. ספקטרה אלה נאספים באמצעות הפעם 90 ° עם הזמן בין רכישות FID (TR) של 5x כ T ₁ של ה-PCR (20 שניות. בשעה 7 T). אלה ישמשו כימות של רמות ה-PCR ו-P _i מ MR ספקטרה.

איסכמי ניסוי

1. ההפרעות איסכמי פשוט מאפשר קביעה של ייצור מנוחה מקסימלית ATP במיטוכונדריה על ידי מדידת השינויים phosphocreatine במהלך ומיד לאחר איסכמיה.
2. הגדרת מערך לאיסוף ספקטרום מרובים באמצעות הדופק רוחב 45 ° (כלומר, 0.5 x 90 ° זמן) ו TR של 0.5x-T ₁ (~ 1.5 שניות.). בדרך כלל אנו אוספים 4 FIDs עבור כל ספקטרום (מספר ממוצע (na) = 4 VNMR תוכנה) לפתרון זמן של כ 6 שניות. זו החלטה זמן מספיק כדי לקבוע במדויק מנוחה מקסימלית המיטוכונדריה ייצור ATP.
3. איסוף ספקטרום המנוחה במשך כ 5 דקות.
4. להשרות איסכמיה ידי ניפוח השרוול עד 270-300 מ"מ כספית במשך 10-12 דקות.
5. שחרר את השרוול לאסוף ספקטרה התאוששות במשך 5 דקות.
6. הסר את החללית מן מגנט והעכבר מן החללית. אפשר העכבר כדי להתאושש מן ההרדמה בתנאים המתאימים. ניסויים ניתן לחזור על הימים הבאים. בעקבות הניסוי הסופי ספקטרוסקופיה שרירי הרגל עכבר יוסרו לאלתר להקפיא הידק בנוזל N ₂ לניתוח של ריכוזי ה-ATP על ידי HPLC.

ניתוח נתונים

1. הנתונים נותחו מחובר באמצעות אחד כמה תוכניות ניתוח ספקטרלי עבור ספקטרום NMR. המעבדה שלנו משתמשת בדרך כלל להתאים לרמת ² ו jMRUI (http://www.mrui.uab.es/mrui/mrui_Overview.shtml) לכימות אזורים שיא.
2. התחלתי שיעורי PCR התמוטטות במהלך איסכמיה הם מידה של ייצור ה-ATP במיטוכונדריה בתנאים normoxic כפי שתואר בכמה מאמרים ^3-5. PCR שיעורי ההחלמה יכול לשמש כדי לקבוע את הקיבולת המקסימלית לייצור ATP במיטוכונדריה מבוסס על הגישה המתוארת לעיל ^4,6.

באיור 1. בהגדרת MRI vivo הנצפים מהחזית של המגנט לשעמם. ההתקנה כוללת סליל RF, התחממות מערכת חיה (או מערכת מחזור מים חמים) ולהוסיף צבע. כל המרכיבים הללו מוכנסים לתוך מגנט אופקי. מים חמים מחוממת למאגר מים מחוץ לחדר מגנט והציג לתוך מערכת חיה ההתחממות דרך צינור Tygon (קלטת ירוקה). לאחר במחזור גליל, מים נמשך ממערכת ההתחממות בחזרה למאגר המים להיות מחומם. צינור isoflurane צינור ואקום משמשים להרדים במהלך הניסויים בעכברים MRI.

איור 2 ב תמונות עבור vivo עכבר בעירום עם גידול xenograft (D282 הגידול) על גבו (חץ) עם אפקטים הרפיה שונות: א. T ₁ שקל תמונה (TR / TE = 500/14.2ms). ב T ₂ שקל תמונה (TR / TE = 2s/40ms). T ₁ ו-T ₂ שתי תמונות משוקלל נרכשו על ידי רצף הד ספין. ג המפה T ₂ מעובד עם 4 סטים של תמונות נרכשה על ידי אונטערשיידferent TE ערכים הנעים בין 20-80 מילישניות. ד T ₂ * תמונה שקל (TR / TE = 180/7.39ms, להעיף זווית = 20 מעלות) נרכשה על ידי רצף הד הדרגתי. שדה ראייה של 35 מ"מ 35 x ² עבור כל התמונות MR.

איור 3. איור של העכבר ממוקם בעל גוף מאוזן עם רגל מאובטחת סליל RF.

איור 4. Vivo ³¹ P ספקטרה דרך מחזור אחד reperfusion איסכמיה. הנתונים נאספו על מגנט T 7 נשא קו אנכי והרחיב עם מסנן מעריכי 20 הרץ. TR = 1, na = 4, כל ספקטרום 20 הם זממו.

טבלה 1. מינון של הרדמה עבור העכבר MRI / MRS.

בעל חיים מין	מאלחש סוכן	מנה (מ"ג / ק"ג עבור הזרקה)	מסלול
עכבר	Isoflurane גז	4.0% במשך 2-3 דקות (אינדוקציה), ואז 1.2-1.5% ברציפות (תחזוקה)	בשאיפה דרך האף חרוט
עכבר	Avertin	5% ממשקל הגוף 10ml/kg	intraperitoneal (IP)
עכבר	קטמין / Xylazine	100 מ"ג / ק"ג ו - 10 מ"ג / ק"ג	IP

טבלה 2. תמונה עם במשקלים הרפיה

תמונה שקלול	TR (עיכוב למחזר)	TE (הד הזמן)
T1	קצר (פחות מ T1)	קצר (פחות מ T2)
T2	לונג (3 ~ 5 פעמים T1)	ארוך (סביב T2)
פ"ד (צפיפות פרוטונים)	לונג (3 ~ 5 פעמים T1)	קצר (פחות מ T2)

T1: סריג ספין הרפיה (או הרפיה אורך) זמן
T2: ספין ספין הרפיה (או הרפיה רוחבי) זמן

Discussion

טרום הרכישה מדרגות מנגינה / גפרור shimming הם קריטיים לרכוש ברזולוציה מרחבית גבוהה יחס גבוה אות לרעש (SNR). חשוב גם לעקוב אחר תנאי חיים עם מערכת חיה ניטור לשמור על מצב פיזיולוגי יציב לבעלי חיים במהלך רכישות אות לקיים טיפול בבעלי חיים אנושית כדי למנוע כל המדידות artifactual פוטנציאליים. נהלים הסביר בפרוטוקול ניתן לשנות לרכוש מידע נוסף כולל הדמיה, דיפוזיה זלוף וזרימה וספקטרוסקופיה מקומי in vivo. כל ההכנות בעלי חיים צריכים להיות דומים, אלא אם כן נוהל מחייב התקנה משלים. הפרוטוקולים של ה-MRI ו - MRS המתוארים במחקר זה שימשו במשך מספר יישומים, כולל מחקרי אורך MRI לפיתוח nanoprobes למקד גידולים ⁷ ו גברת מחקרים לייצור ATP במיטוכונדריה ^5,8. MRI ו MRS טכניקות שימושי noninvasively לדמיין אנטומיים בעלי חיים, לשנות הרפיה או nondestructively לפקח חילוף החומרים. טכניקות שניהם יכולים לשמש נהלי ניטור האורך לבחון הנ"ל שינויים לאורך זמן. עבור גברת בנינו בדיקה אישית RF המאפשרת חיים להישמר במצב אופקי מגנט משעמם אנכי. לפיכך, ניסויים אלה ניתן לבצע על מגנט כל רחב נשא אנכי, כגון נמצא במחלקות כימיה ביותר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inova 200 MR scanner/4.7 T	Varian Inc., Agilent		Used for mouse MRI
Inova 300 NMR spectrometer/7 T	Varian Inc., Agilent		Used for MRS of mouse skeletal muscle