Неинвазивная В Vivo Маленькое Существо МРТ и МРС: Основные экспериментальные процедуры

Summary

Эта работа описывает основные процедуры неинвазивных маленькое животное МРТ и МРС

Abstract

Малый животных магнитного резонанса (МР) исследования стала важным элементом современных биомедицинских исследований из-за его неинвазивной природы и богатство биологической информации, которую он обеспечивает. MR не требует никаких ионизирующего излучения и может неинвазивно обеспечивают более высокое разрешение и лучше сигнал-шум по сравнению с другими томографического или спектроскопических методов. В этом протоколе, мы сосредоточим внимание на мелких животных МРТ и МР-спектроскопия (МРТ / МРС) для неинвазивного приобрести релаксации взвешенный

Protocol

Часть 1: Магнит безопасности

Оба МРТ и МРС использовании сильного магнитного поля, что требует крайней осторожности. Например, 4,7 Т инструмент, который мы использовали для настоящей работы имеет магнитное поле примерно в 90000 раз магнитного поля Земли. Сильное магнитное поле всегда, даже когда сканер MR не используется. Любой металлический предмет, который вступает в контакт с таким сильным магнитным полем будет сильно и быстро привлекают магнита. Это очень опасно, если испытуемый или оператора находится в пути снаряда металлический предмет, летя в магнит. Таким образом, сотрудники, которые проводят MR экспериментов должны быть осторожны, чтобы удалить любые металлические предметы одежды перед входом близость прибора, а также сохранить окружающую среду, свободную от таких объектов. Более подробную информацию о магнит безопасности появляется в литературе ¹ и следующие веб-страницы: http://www.imrser.org/ . Наличие металлического материала может не только вызвать выше проблем безопасности, но вмешиваться в экспериментальных результатов, вызывая изображения / спектроскопических артефактов. Металлические представить материал вблизи или внутри изображения объекта может изменить магнитное поле в окрестности и так генерировать артефакты на полученные изображения или расширить ширину линии спектров.

Соответственно, оставить бумажник, ключи, ручки и т.д. вне магнита, если Вы обращаетесь с животными для процедур, MR.

Часть 2: В Vivo МРТ Мышь в горизонтальное отверстие Магнит

Животное Подготовка к МРТ

1. Все процедуры животное должно быть одобрено институционального ухода за животными и использовать комитета (IACUC) до выполнения любых видов животных обработки.
2. Мы используем испаряется изофлуран для обезболивания животных для МРТ эксперименты. Анестезия животных может быть достигнуто за счет других анестетиков, таких как авэртин (2,2,2-tribromoethanol или КЭ) и коктейль из кетамина и ксилазина. Дозировка информация каждого анестетика находится в таблице 1.
3. Линии индукции камеры с пластиковыми поддержал абсорбирующей прокладки (синие панели или патрон). Место мыши (или нескольких мышей в течение нескольких изображений мыши) в индукции камеры.
4. Отрегулируйте расходомер изофлуран испаритель до 0,8 1,5 л / мин. Затем настройте изофлуран испаритель до 4% в течение 2 3 минут.
5. После достижения хирургического наркоза плоскости (то есть без ответа носок щепотку), навести мышь на животных держатель с носом вставляется в носовой конус (или маска). Голову фиксатор может быть использована для обработки изображений и глава тела держатель может использоваться для визуализации тела.
6. Животное держатели используются для предотвращения потенциального движения: Есть несколько типов коммерческих владельцев. Кроме того, специально созданных держателя могут быть изготовлены для размещения любых особых требований экспериментальной установки. Для специально созданных держатель, убедитесь, что используются только немагнитных материалов.
7. Во время визуализации период, настроить расходомер на 0,4 0,8 мл / мин и снизить изофлуран испаритель на 1,2 1,5%. Истек газа, поступающего из конуса носа мыши собирается насосом и удаляется в внутреннего вакуума.
8. Глаза животного будет влажной стерильной мази смазочных глаза. Животное будет храниться при температуре 35-37 ° С в течение эксперимента в теплой система циркуляции воды. Другие типы источников тепла могут быть использованы такие, как нагревается колодки и теплый воздух выдувается в радиочастотной (РЧ) катушки.
9. Система мониторинга животного для мониторинга температуры тела, дыхания / сердечного цикла, и синхронизировать дыхание / сердечной стробирования с изображением приобретений.
10. Стандартный образец изготовлен из агарозы находится рядом с животным следить резкое изменение сигнала. Это стандартный образец агар особенно полезно для мульти-ломтик и мульти-временной точке изображения. Когда неожиданное изменение обнаружен сигнал в часть из полученных изображений, срез с неожиданным изменением сигнала могут быть устранены. Кроме того, его интенсивность сигнала может быть настроен на основе изменения сигнала стандартного образца в процессе пост-анализа изображений.
11. После надежно размещения животных и мониторинга компонентов на животных держатель, положение животного владельцу в центре РФ катушку.
12. Перемещение РФ катушки к магниту комнату и вставьте катушку РФ в теплую системы циркуляции воды помещается внутри магнита. На рисунке 2 показаны некоторые компоненты магнитно-резонансной томографии наблюдали из передней части отверстие магнита.

МРТ Эксперимент

1. Tune РФ катушку ¹ резонансной частоты H и соответствуют волновым сопротивлением катушки 50 Ом использованием настройки панели сканера MR. Это необходимо для достижения оптимальных условий приема сигнала. Большинство человеческих МРТ сканеры не требуют отдельного процесса настройки / матч за исключениемВ MRS процедур.
2. Поведение прокладок процесс с использованием одной последовательности импульсов. Сигнал MR опирается на экологические магнитного однородность поля. Шиммирования процесс позволяет магнитного поля в области, представляющие интерес для столь однородна, как это возможно. Каждый сканер MR имеет свой собственный способ выполнить шиммирования процесса, в том числе автоматическое быстро шиммирования процессов, таких как быстрый карте и градиент прокладок.
3. Оптимизация РЧ импульс за счет максимального одномерного изображения профиля. Радиоимпульс полномочия могут быть выстроены, сохраняя при этом длительность импульса постоянной и достаточно долго, TR (переработке задержки), что составляет примерно 3 - 5 раз T ₁ тканей.
4. Приобретать разведчик изображения вдоль трех ортогональных ориентаций создать осевые, корональной и сагиттальной изображений. Быстрой последовательности захвата изображений (т.е. эхо градиент или быстро спиновое эхо отображающей последовательности) могут быть использованы для приобретения разведчик изображений. Полученные изображения будут использованы для планирования фактические изображения с определением изображений самолетов.
5. Изменение спиновое эхо последовательность. Выберите соответствующие параметры последовательности: TR (переработке задержки) должны быть три-пять раз ткани T ₁ приобретать полностью расслабленным изображений, таких как плотность протонов или T ₂ взвешенных изображениях. TE (эхо времени) длительности между первым импульсом РФ и центра эхо-сигнала. Значение TE может быть выбран в зависимости от контраста изображения как показано в таблице 2. На рисунке 2 показан в естественных изображений, полученных с различными эффектами релаксации T _1, T ₂ и T ₂ * для мыши с обнаженной ксенотрансплантата опухоли на спине.
6. T ₂ измерений может быть сделано либо с помощью multiecho изображений или отдельных изображений эхо с несколькими значениями TE.
7. После МРТ / МРС в естественных условиях эксперимента, животные должны быть проверены по всему процессу восстановления. После МРТ, животные будут выведены из РФ катушку и мониторинг для обеспечения полного восстановления, когда вернулся в клетку. Потери тепла происходит быстро под наркозом мышей. Держите животных теплой, покрывая их марлей подушки или полотенца и / или предоставление источника тепла, пока животные оправилась от наркоза.

Обработка изображений

1. Обзор полученных изображений на консоли МР и передачи выбранных данных на пост-обработки компьютером.
2. Обычно мы используем ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) для анализа изображений. Анализа изображений включает в себя масштабирование изображения / фильтрации, расчеты T _1, T ₂ и диффузию, опухоль измерения объема и сегментации опухолей.

Часть 3. В Vivo MRS для мыши задних конечностей скелетной мышце в вертикальные отверстия магнита

Строительство манжеты для стимулирования Реверсивные ишемии

1. Начать с куском трубы ПВХ, что составляет примерно 5-7 мм с внутренним диаметром 12-15 мм. Просверлить маленькое отверстие в стене этой части и нити.
2. Сократите часть воздушного шара, так что открытым на обоих концах (воздушные шарики гелием качество работы лучше всего). Вставьте этот кусок через кусок ПВХ и оберните вокруг спины и ленты концы на внешней стене кусок ПВХ.
3. Используйте термоусадочная пленка для уплотнения шара концов вокруг трубы. Вы должны иметь манжеты с твердой внешней стены и надувные внутренней стенке.
4. Вырежьте области термоусадочная пленка и воздушный шар вокруг отверстие с резьбой, заботясь, чтобы оставить достаточно материала между отверстием и краем кусок ПВХ. Тема 1.5 см кусок цветного металла (например, латунь) в отверстие в ПВХ. Это позволяет надувать манжету. Печать области с 5 минут эпоксидной смолы.
5. Устранить манжеты на место рядом с катушкой РФ в зонд MRS и подключения к внешним сфигмоманометра.

Custom Монитор дыхания

1. Мы используем индивидуальный заказ дыхание монитор, который сделан для совместимости с ограниченным пространством и доступом к отверстие магнита. Некоторые коммерческие модели также доступны.
2. Tie баллончик до конца растянуть стойких труб подается в зонд.
3. Присоединить другой конец трубки с датчиком давления.
4. Убедитесь, что линии и воздушный шар не содержит пузырьков воздуха. Пузырьки будут ослаблять сигнал от сжатия воздушного шара, вызванное движением мыши тела из-за дыхания.

Мышь Позиционирование в MRS зонда

1. Обезболить мышь с 5% Avertin (0,010 мл / г массы тела).
2. После достижения хирургического наркоза плоскости, положение мыши в MRS зонд путем размещения мыши на спине на поддержку мыши. Место заполненные жидкостью баллон на брюшной стороне мыши и в безопасности в месте с ремнями поддержку мыши.
3. Мыши Положение и тела поддержку в зонд MRS.
4. Вытяните один задних конечностей через ишемический манжеты и MRS катушку. Нога должна быть сосредоточена в катушке, как муч, насколько возможно. Такое расположение позволяет корпусе мыши должен быть расположен горизонтально в вертикальных отверстие магнита (рис. 3).
5. Fix ноги на месте с помощью записи на пленку ноги на жесткой опоре.
6. Место термопары подкожно в задних конечностей за пределами региона, отобранных катушку.
7. Смочите глаза глазная мазь, чтобы предотвратить смазывание глаз от высыхания. Обложка мыши глаза и лицо, чтобы предотвратить натирание или раздражение от стенки зонда.
8. Другие датчики мониторинга могут быть добавлены в зависимости от конкретных потребностей эксперимента.

Настройка MRS Эксперимент

1. Подключите воздушный поток для нагревательного элемента на зонде MRS.
2. Установите переменную блок управления температурой на программное обеспечение VNMR поддерживать ногу температура 35-37 ° С.
3. Настройка частоты катушки и согласование сопротивлений использованием настройки панели в программном обеспечении MRS для ¹ Н и ³¹ Р резонансов.
4. Отрегулируйте шиммирования схем оптимизации однородности B1 магнитного поля в области интереса с использованием ¹ Н спектроскопии.
5. Переключить на ³¹ Р-частота для определения ширины импульса РФ, чтобы получить максимальное сигнал от одного спада свободной индукции (FID) (90 ° времени).
6. Сбор высокий сигнал-шум полностью расслабленным спектры (ФРС), чтобы определить соотношение неорганического фосфата (P _я) и фосфокреатина (ПЦР) в СПС при полностью расслабленной условиях. Эти спектры получены с помощью 90 ° время от времени между приобретениями FID (TR) примерно в 5 раз T ₁ ПЦР (20 сек. В 7 т). Они будут использоваться для количественного определения ПЦР и P уровней _я у г-спектров.

Ишемическая Эксперимент

1. Простой ишемической возмущений позволяет для определения максимального отдыха и митохондриальной производства АТФ измерения изменений в фосфокреатина во время и сразу после ишемии.
2. Настройка массива собрать несколько спектров с использованием 45 ° ширины импульса (то есть 0,5 х 90 °, время) и TR в 0.5x T ₁ (~ 1,5 сек.). Как правило, мы собираем 4 FIDS для каждого спектра (число усреднений (па) = 4 в VNMR программное обеспечение) для временного разрешения около 6 секунд. На этот раз разрешение достаточно точно определить отдыха и максимального производства митохондриальной АТФ.
3. Сбор отдыха спектров в течение примерно 5 минут.
4. Вызвать ишемии, раздувая манжеты на 270-300 мм рт.ст. в течение 10-12 минут.
5. Выпуск манжеты и собирать восстановления спектров в течение 5 минут.
6. Удаление зонда от магнита и мышь от зонда. Разрешить мыши, чтобы оправиться от наркоза при соответствующих условиях. Эксперименты могут повторяться в последующие дни. После окончательного спектроскопии эксперимента мышцы мыши нога удаляются и немедленно заморозить, зажатый в жидком N ₂ для анализа концентрации АТФ с помощью ВЭЖХ.

Анализ данных

1. Данные проанализированы сообщения с помощью одного из нескольких спектральных программ для анализа спектров ЯМР. Наша лаборатория обычно использует подходят к стандартным ² и jMRUI (http://www.mrui.uab.es/mrui/mrui_Overview.shtml) для количественного площадей пиков.
2. Первоначальная разбивка PCr ставки при ишемии являются мерой митохондриальной производства АТФ под гипоксическим условиям, как это описано в ряде работ ^3-5. PCr восстановления ставки могут быть использованы для определения максимальной мощности для производства митохондриальной АТФ на основе подхода, описанного ранее ^4,6.

Рисунок 1. В естественных условиях МРТ установки осмотре перед отверстие магнита. Установка состоит из РФ катушки, система животного потеплении (или теплый системы циркуляции воды) и градиент вставки. Все эти компоненты вставляются в горизонтальной магните. Теплая вода нагревается в водохранилище за пределами магнита комнату и внедрены в системе потепления животных через трубку Tygon (зеленая лента). После циркулирующих в цилиндре, вода берется из потепление систему обратно в водохранилище будет нагреваться. Изофлуран трубы и вакуумной трубки используются для обезболивания мышей во время МРТ эксперименты.

Рисунок 2 В естественных изображений для мыши с обнаженной ксенотрансплантата опухоли (D282 опухоль) на спине (стрелка) с различными эффектами релаксации. A. T ₁ весил изображения (TR / TE = 500/14.2ms). Б. T ₂ весил изображения (TR / TE = 2s/40ms). Оба Т ₁ и Т ₂ взвешенных изображениях были приобретены спина последовательности эхо. С. Т ₂ карты обрабатываются с 4 комплекта изображений, полученных с DIFразличными значениями TE от 20 до 80 мс. Д. T ₂ * весил изображения (TR / TE = 180/7.39ms, флип угол = 20 градусов), приобретенных градиент последовательности эхо. Поле зрения 35 х 35 мм ^2, для всех изображений MR.

Рисунок 3. Иллюстрация мышь позиционируется в горизонтальном держателе тела с ноги закреплены в РФ катушку.

Рисунок 4. В естественных условиях ³¹ Р-спектров через один цикл реперфузия ишемии. Данные были собраны на 7 Т вертикальные отверстия магнита и линии расширили с 20 Гц экспоненциальный фильтр. TR = 1, па = 4, каждые 20 спектры построены.

Таблица 1. Дозировка анестетик для мыши МРТ / MRS.

Животное Вид	Обезболивающий Агент	Доза (Мг / кг для инъекций)	Маршрут
Мышь	Изофлюрана газа	4,0% в течение 2-3 мин (индукция), то от 1,2 до 1,5% в непрерывном режиме (техническое обслуживание)	Ингаляционные через носовой конус
Мышь	Avertin	5%, 10ml/kg массы тела	внутрибрюшинно (IP)
Мышь	Кетамин / Ксилазин	100 мг / кг и 10 мг / кг	IP

Таблица 2. Изображение с релаксацией веса

Изображение взвешивания	TR (переработке задержки)	TE (эхо времени)
T1	Короткий (короче T1)	Короткий (короче Т2)
T2	Длинные (3 ~ 5 раз T1)	Длинный (около Т2)
PD (плотность протонов)	Длинные (3 ~ 5 раз T1)	Короткий (короче Т2)

T1: спин решеточной релаксации (или продольная релаксация) время
T2: спин спиновой релаксации (или поперечной релаксации) время

Discussion

До приобретения шаги настройки / матч и прокладок имеют решающее значение для приобретения высоким пространственным разрешением и высоким отношением сигнал-шум (SNR). Важно также следить животное условиях с системой мониторинга животного для поддержания стабильной физиологического состояния животных во время сигнала поглощения соблюдать гуманные обработки животных и предотвратить любые потенциальные искусственной измерений. Процедуры описаны в протоколе могут быть изменены, чтобы приобрести дополнительную информацию, в том числе диффузии, перфузии и поток изображений и локализованных спектроскопия в естественных условиях. Все препараты животного должны быть похожи, если процедура требует дополнительных настроек. Протоколы МРТ и МРС, описанных в данном исследовании были использованы для нескольких приложений, включая продольной МРТ исследования для развития нанозонды целевому опухолей ⁷ и MRS исследования по митохондриальной АТФ ^5,8. МРТ и МРС полезны методы неинвазивно визуализировать анатомические животных, релаксация изменить или неразрушающего мониторинга обмена веществ. Оба метода могут быть использованы в качестве продольной процедуры мониторинга для изучения указанных изменений с течением времени. Для MRS мы создали пользовательский зонд РФ, который позволяет животному будет поддерживаться в горизонтальном положении в вертикальных отверстия магнита. Таким образом, эти эксперименты могут быть выполнены на любой вертикальной широким отверстием магнит, такие как это имеет место в большинстве департаментов химии.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inova 200 MR scanner/4.7 T	Varian Inc., Agilent		Used for mouse MRI
Inova 300 NMR spectrometer/7 T	Varian Inc., Agilent		Used for MRS of mouse skeletal muscle