Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

צפה היסטורי הפגנה לפיזיולוגיה NMJ של השריר פותחן סרטן הנהרות

doi: 10.3791/1595 Published: November 9, 2009

Summary

השריר פותחן של הרגל סרטנים מוצג חשיבותו ההיסטורית צדדיות ניסיוני פנוטיפ שרירים, פיזיולוגיה ואת הפלסטיות הסינפטית.

Abstract

כאן אנו מציגים חלק מן התגליות החשובות מפתח עשה עם הכנת neuromuscular (NMJ) פותחן של סרטנים להמחיש כי יש עדיין הרבה מה ללמוד הכנה מודל זה. להבנת ההיסטוריה אפשר להעריך מדוע גם היום NMJ זה עדיין מציעה שעשועים עשיר במטרה לענות על שאלות לגבי תפקוד טרום ופוסט סינפטיים ו הפלסטיות. כדאיות ונוחות גישה למסוף עבור electrophysiology תאיים כמו גם תאי הדמיה יתרונות משמעותיים. המנגנונים מאחורי אפנון של קינטיקה שלפוחי ואיחוי בתוך מסופי גבוהה ונמוכה פלט מתחננים לחקירה. הכנה מציע גם מערכת מודל testable הערכות ומניפולציות חישוביות לבחון משתנים מפתח המודלים התיאורטיים של תפקוד סינפטי, למשל דינמיקה סידן במהלך סיוע לטווח קצר. המורכבות סינפטי של אזור פעיל אופי סטטיסטי של שחרור quantal גם בשטח פתוח לחקירה בעתיד הן בניסוי ואת המחשוב.

Protocol

הקדמה

בצמתים neuromuscular של סרטנים סיפקו תרומות חשובות פיזיולוגיה במיוחד הפיזיולוגיה הסינפטי לאורך השנים. הקלות ב דיסקציה ואת הכדאיות הם כנראה הגורמים המרכזיים אשר קידם הפיזיולוג אנטומיה ומאוחר יותר מוקדם להשתמש סרטנים כמו ההכנות ניסיוני. סרטן הנהרות בפרט להשגה בקלות נחלים ואגמים מתוקים ביותר, וכן הם קל לשמור במעבדה הגדרה לעומת סרטנים הדורשים מים קרים, מלח הסביבה.

הזואולוג חזרה בסוף 1800 זה לקח ללב במיוחד מינים סרטנאים (כלומר, crayfishes) וכתב ספר ששמו סרטן הנהרות ( הקסלי , 1879). טקסט זה שימש הספר מדריך על אורגניזמים אלה במשך שנים והיום הוא שיבח עדיין כספר מקיף סלקטיבי על crayfishes העוסק בתולדות החיים, אנטומיה ופיזיולוגיה. האקסלי צפו סרטנים כחיית מודל לצלול למעמקי זואולוגיה בכל ההיבטים, ולכן הטבע המקיף של ספרו. העיתוי היה יתרון כמו הפיזיולוגיה היה פורח בסוף 1880 של הבנה של Ringer של יונים הנדרשים לשמירה על הלב צפרדע ההכנות (Ringer, 1882a, b). זה עשוי אחת הסיבות ניסויים פיזיולוגיים התקדם במהירות במינים אחרים, כמו גם סרטנים. כמו כן, מי מלח כדי לשמור על ההכנות סרטנאים היה מתואר על ידי ואן Harreveld בשנת 1936.

באופן מפתיע העצבוב של השריר פותחן ברגליים סרטנים היה גם להיות מאופיין בערך בזמן הזה בהיסטוריה (בידרמן, 1887). אבל עוד יותר מפתיע הוא כי מחקרים פיזיולוגיים כבר היו בעיצומן בשרירים של סרטנים על ידי צ'רלס Richet בצרפת. למעשה, הניסויים סרטנים עשוי להיות הראשון להראות סיוע ב neuromuscular (NMJ) (Richet, 1879; גם לראות Richet, 1881). במהלך העשורים הקרובים NMJs סרטנים היו להיות מתואר מבחינה אנטומית פיזיולוגית ביחס להתפתחות מתח אנטומיה (ואן Harreveld ו Wiersma, 1936).

הופעתו של הקלטה תאיים, עם אלקטרודות חדה (לינג ואת ג'רארד, 1949), החיו את שדה כתובת קבוצות שונות של שאלות. שרירי סרטנאים היו ידועים לייצר התכווצויות מדורגים (כץ & Kuffler 1946; כץ, 1949; Wiersma, 1949), אבל זה לא היה עד 1953, כי פט וכץ רשמה הפוטנציאלים הטרנסממברני של סיוע לטווח הקצר בסיבי השריר סרטן.

השריר פותחן בגפיים של סרטנים הודגש שוב בשנת 1961 כאשר דוד 'ל ו Kuffler הפגינו סיוע בשריר הזה והראה בפעם 1 st תופעות של עיכוב presynaptic (1961a, b; דוד' ל, 1963, 1965a). הם גם דיווחו על אופי quantal של שידור הסינפטי על זה NMJ (1961b). ב 50 השנים האחרונות חלה לא מעט תשומת לב ניתנה הכנת וטכניקות שונות להשתמש כדי לפקח על הפיזיולוגיה הסינפטי. במשך קצרה על הנוף של חקירות באמצעות הכנה, אנחנו מתחילים עם וציין כי השריר כולו innervated ידי אחד הגירוי ואת האקסון מעכבות אשר יכול להיות מגורה באופן סלקטיבי. אטווד (1964) הפגינו עם רכבות של גירוי הפוטנציאלים postsynaptic הגירוי הקל והפיק מתח שרירים. Iravani (1965) דיווחו על הבדלים אזוריים בתגובות הסינפטי בהתאם לאזור של שריר. זמן קצר לאחר מכן דוד 'ל (1965a, b) רשמה הפוטנציאל לאורך העצב על מסופי פותחן ו הוכיח כי סרוטונין משופרת neuromodulator בשידור סינפטי על ידי הגדלת אומר תוכן quantal.

בשלב זה נקבע כי השרירים סרטנאים הגיב גלוטמט וחומצות אמינו שונות, כמו גם GABA (ואן Harreveld ו מנדלסון, 1959; רובינס, 1959;. Kerkut et al, 1965). התגובות המעכבת של גאבא זוהה על ידי Florey (Bazemore et al., 1956, 1957) ואחרים (Boistel ו פט, 1958). מאוחר יותר GABA היה מבודד ואושרו על ידי Kravtiz (קרביץ ואת פוטר, 1965; קרביץ et al, 1963a, b;. קרביץ, 1962) מן האקסונים ההכנות פותחן לובסטר.

שרירי סרטנים הציע לא רק ההכנות נגיש אך מאפשר ללמוד איך מנוע בודד נוירונים לזיהוי יכול לגרום לתגובות postsynaptic שונים ברמה פיזיולוגית מבניים. בפרט השריר פותחן היא מעוצבבים על ידי עצב מוטורי אחד מעוררים, אבל postsynaptic פוטנציאלים מעוררים (EPSPs) במיקומים שונים יכול להשתנות על פי 50 בסיבים שטחית הגבי (Bittner, 1968a, b) ו ככל 8 פי שטחי הגחון סיבים (Iravani, 1965).

"> עם הזרע לגלות כי NMJ פותחן ב סרטנים הוצגו לטווח ארוך סיוע (LTF) (שרמן אטווד, 1971), בנוסף סיוע לטווח קצר, את הבסיס מכניסטי התופעות האלה צריך לטפל. כאשר צד , שים לב לטווח ארוך potentiation (LTP) התגלה במוח החולייתנים שנתיים לאחר מכן (בליס L מו, 1973) ללא ציון לשבח על גילוי המקור של התופעה על NMJ סרטנים. מתקופה זו על חוקרים רבים התמקדו מייחס את של STF ו LTF באמצעות NMJ פותחן של סרטנים ללמוד את מנגנוני הסלולר (אטווד, 1973, 1976, 1982; אטווד et al, 1994;. צוקר, 1973, 1974a, b; Bittner ו סיוול, 1976;. פרנס ואח', 1982a, b, c, d, דוד 'ל et al, 1983;.. Vyshedskiy ו לין, 1997a, b, c), כמו כן נקודת המיקוד כבר להבין כיצד תא עצב בודד מנוע innervating שונים סיבי השרירים על השריר פותחן יכול להצמיח עד כה התגובות הסינפטי מגוונת (לינדר, 1974; G ¨ nzel et al, 1993;. גובינד et al, 1994;. Iravani, 1965; אטווד, 1967; Bittner, 1968a, b; שרמן אטווד, 1972; צוקר, 1974a; פרנס et al, 1982a;. צוקר והיידון, 1988; דוד 'ל, 1989a, b, c, d).

מבנה Synaptic כדי להסביר את התגובות הסינפטי ההפרש יכול להיחקר באמצעות ניתוח ultrastructural (Jahromi ו אטווד, 1974). מדדי הבדלים יוניים עקב פעילות מסוגל להיחקר עם זריקות axonal של Ca2 + ו Na + אינדיקטורים כמו גם Ca2 + buffers (Mulkey ו צוקר 1993;. וינסלו et al, 2002), ואלה והנתיבים יכול להיות המודל בתוך הטרמינל (וינסלו et al, 1994;. Cooper et al, 1996b).. פעילות עיבודים תלויה (אטווד et al, 1991). וזיהוי תרופתי של תת neuromodulator קולטן (Dropic et al, 2005;. Ruffner et al, 1999;. ניצוצות וקופר, 2004; Sparks et al, 2004;. תבור קופר , 2002;) המשפיעים בריכות שלפוחית ​​סינפטית ו קינטיקה (לוגסי et al, 2005;. סאוט et al, 2000;.. Sparks et al, 2003) גם נבדק אשר מובילה את הדרך לשאלות חדשות להתייחס. המושגים של תפקידו של סידן במהלך STF לעומת שלילת קוטביות הממברנה בשידור סינפטי על NMJ פותחן להוביל כמה הבדלים בדעת (Mulkey ו צוקר, 1991; הוכנר et al, 1989).

יחסית לאחרונה בידול האזורי כוח הסינפטי ועל סיוע מן הנוירון המוטורי יחיד, טופלה ונראה כי בשל ההבדלים משינויים presynaptic המקומית במבנה הסינפטי ופיזיולוגיה (אטווד et al, 1994;. אטווד קופר, 1995, 1996a , b; קופר et al, 1995b, 1996a, b).. ניתוח Ultrastructural ממחקרים micrographic אלקטרונים הראו כי ורידים מכילים את רוב המגעים הסינפטיים (Florey ו קייהיל, 1982;. Cooper et al, 1995b). עוצמת השידור הסינפטי פוחתת לאורך מסוף יחיד שנראה בשל המורכבות של המבנה הסינפטי (Cooper et al, 1996a,.. גובינד et al, 1994). ההבדלים במבנה הסינפטי יכול להסביר חלקית את ההבדלים Ca2 + זרם במהלך גירוי בתדרים שונים (Cooper et al. 1995b, 1996b).

מאחר שקיימים הבדלים אזוריים פנוטיפ שרירים ביוכימיה בין סיבי השריר של פותחן (G ¨ nzel, et al, 1993;.. Mykles et al, 2002) אשר מחולק לאזורים, יכול להסביר פנוטיפ שריר מוסדר מבחינה התפתחותית כי השפעות ושומר על הבדלים אזוריים של הנוירון המוטורי (Mykles et al., 2002). הרעיון של השפעות מדרדר נחקר בשרירי השלד צפרדע (Nudell ו גרינל, 1983), ב לובסטר (כץ et al., 1993), וכן סרטנים (Lnenicka ואת מלון, 1983) עם ראיות משכנעות סביר. תקנה מקומית של מסופים נוירון בודד בלי להשפיע מסופים אחרים מרחבית הנמנע בנוירונים סרטנאים מנוע כי המסופים ניתן למדוד מתוך 1cm כדי במרחק 10 ס"מ אחד מהשני. בניגוד חוליות, יחידת המנוע עשויים לכלול יותר שאחד שריר חסרי חוליות (ראה סקירה של אטווד, 1973). הנוירון המוטורי מעורר כי innervates השריר פותחן כולו גם innervates השריר אלונקה במגזר רגל פרוקסימלי יותר. מדידות סיוע בין סיבי שריר של שריר פותחן הראו כי ישנם הבדלים שעשויים להיות קשורים לרמות מנוחה Ca2 + יונים (Cooper et al. 2005b) ו / או אולי בשיתוף פעולה של שחרור (פרנס et al. 1982a, b)

ההבדלים במורכבות מבנית בין הסינפסות גבוהה ונמוכה פלט לאורך מסופי על השריר פותחן נחקרו עבור חתימות quantal לגבי גיוס actiיש אזורי בין הסינפסות במהלך STF אבל זה הוכיח להיות קשה לקבוע (לנקסטר et al, 2007;. Viele et al, 2003, 2006.). אפשריות בריכות של שלפוחית ​​בין הסינפסות גבוהה ואת התפוקה נמוכה יתברר מוסדר באופן דיפרנציאלי על קינטיקה כפי שהוא מוכר neromodulators יש השפעות שונות על מסופי נמוך גבוהה פלט (לוגסי et al, 2005;. ניצוצות וקופר, 2004; Cooper et al., 2003).

השימוש העתידי של הכנת פותחן שריר סרטנים עשיר כמו זה כבר 50 או 100 שנה. הכנה עדיין קשוחים מאוד בהשוואה רבים ההכנות סינפטיים אחרים. התגובות Quantal ניתן אלקטרו נרשם ישירות על קשרים סינפטיים גם צילמו כמו סוגים שונים של מסופי מוגדר היטב עבור הדינמיקה שלפוחית. הכנה לא איבד מקסמו בכך נוירונים לזיהוי יחיד עבור התשומות הגירוי ואת מעכבות. למרות סרטנים לא להיות מעשיים מניפולציה גנטית, מחקרים אפשריים לכתובת תפקיד של חלבונים סינפטיים כמו תסיסנית. ישנם קווי דמיון רבים בתפקוד סינפטי אל תסיסנית NMJs (אטווד קופר, 1995, 1996a, ב) כי ניתן לבדוק על ידי מחקרים הזרקת חלבון (הוא et al., 1999). הסדרת בריכות שלפוחית ​​סינפטית בתוך מסופי העצב המוטורי הוא גם אזור עשיר לחקירה בעתיד, כמו גם מחקרים מכניסטית להבין תקנה סידן במהלך STF (דסאי, השאה et al, 2008;. דסאי, השאה קופר, 2009) כדי להסביר רבים מן התעלומות יסודות בשידור סינפטי.

שיטות

בתור

סרטן הנהרות, Procambarus כלארקיי, מדידה 6-10 ס"מ אורך הגוף (Atchafalaya ביולוגית אספקת ושות, Raceland, לוס אנג'לס) הם המושרה על automize את הרגל בהליכה הראשונה או השנייה על ידי צובט בכוח את הקטע ischiopodite.

איור 1
הפעל את הרגל סביב עד שאחד יכול להיות בטוח שבחוץ (צד לרוחב) הוא פונה כלפי מעלה על הצלחת הניתוח. זה בדרך כלל הצד קמור למעלה. הנחת רגל על ​​פיסת נייר כל כך עוזר ההכנה ניתן להפעיל בקלות בעת ביצוע הקיצוצים הללו.

איור 2

עם מפסק להב בעל אזמל סכין גילוח חד משמש לציפורן לחרוט עד עתה חיתוך דרך בדפוס שמוצג בתרשים זה קטע meropodite. הטיפול צריך להיות בשימוש לא לחתוך דיסטלי הרבה על הגב כדי לחתוך הגחון על ידי meropodite - משותף carpopodite. השאירו את לציפורן במקום לעת עתה.

איור 3

איור 4

עם סכין הגילוח אזמל לחרוט את הקוטיקולה על propodite עד עתה חיתוך דרך בדפוס שמוצג בתרשים לעיל במגזר propodite בצד אחד ולאחר מכן לחזור על הצד השני להצטרף חתכים הפרוקסימלי. הטיפול צריך להיות בשימוש לא לחתוך לתוך השריר פותחן. ניתן לעשות זאת על ידי שמירה על הלהב נשען על השריר יותר כאשר חיתוך דרך לציפורן. כמו כן על הגב כדי לחתוך הגחון, חיבור סביב הצד הגחוני, להיזהר לא לחתוך הפרוקסימלי גם בתור חיבור משותף צר ושבירות. השאירו את לציפורן במקום לעת עתה.

איור 5

ההכנות יש להכניס מלוחים. זו מנה לנתיחה צריך ציפוי (Dow Corning) Sylgard בתחתית (1cm עבה). Sylgard משמש כך סיכות חרק יכול להיות תקועה בו לקיום הכנה עדיין. בשלב זה לנעוץ סיכה בפינה הזנב הגב, בתוך החתך, של החלון שנעשו meropodite.
עם פינצטה קנס (# 5) להרים מעט את הקוטיקולה מהקצה הדיסטלי עם התער, לחתוך את סיבי השריר מכופף הרחק לציפורן, חיתוך דיסטלי לאופן הפרוקסימלי. הרם את חלון מחוץ לציפורן.

איור 6

איור 7

עכשיו לחתוך את apodeme (גיד) בבית meropodite - carpopodite משותף (ראה להלן). היזהר מאוד למשוך את גיד הרחק בחלל רגל לפני ביצוע חתך רק לחתוך את הגיד ולא עצב הרגל העיקרי הוא בצד הפנימי של הגיד. לצבוט את הגיד בו נחתך עם פינצטה ומשוך שריר מכופף את ידי הרמתה לכיוון הזנב. עכשיו עצב את הרגל הראשי extensor שריר חשופים.

איור 8

המשך הקטע propodite לחתוך עכשיו ב dactylop propoditeodite משותף. כאן גיד קרוב אולי חתך המצורף לציפורן. משוך את קטע הגחוני (צד שריר יותר) של propodite למטה ובחזרה caudally, כך השריר המחובר באזור הזנב אפשר לראות. חותכים את השרירים האלה בתער. היזהר שלא לחתוך את השריר קרוב מדי משותפת סיכון חיתוך ענף העצב המוטורי לשריר פותחן. השריר פותחן נחשפת כעת מלוחים.

איור 9

איור 10

חזור אל האזור meropodite לבודד את צרורות העצבים המכילה את הנוירונים המנוע הגירוי ואת מעכבות לשריר פותחן. באזור הזנב ביותר של המגזר meropodite את צרור עצב הרגל בדרך כלל מכיל צרור עצב נפרדים. זה האזור שבו שני צרורות קצרים ניתן לראות שם את צרור הגבי ניתן transected במספריים בסדר. סוף חתך אז יכול להיות הרים עם # 5 פינצטה ומשך בעדינות distally עד כמחצית אורכו של קטע meropodite הוא הגיע. זה ענף עצב ארוך מכיל את העצב פותחן מעוררים ואת צרור גדול של עצבים מכיל את הנוירון המוטורי מעכבות של שריר פותחן.

איור 11

איור 12

איור 13

הכנה במגזר meropodite נחתך עכשיו בצורה אלכסונית כך סיכה חרקים ניתן להציב דרך ההיבט הגבי של meropodite. זה עמדות הצד הגחוני של שריר פותחן כך שהוא פונה אל הצופה (כמתואר להלן).

איור 14

איור 15

איור 16

הסיבים שיורית של שריר קרוב שחוסמת את התצוגה של שריר פותחן כעת ניתן להסיר על ידי לחיצה על סיבי נגד לציפורן ומתוך חלל propodite. לפעמים רקמת החיבור המכסה את פותחן אשר ניתן להסירו באמצעות בזהירות באמצעות פינצטה # 5. העצב הרגל העיקרי המשתרע לאורך השריר פותחן ונכנס dactylopodite ניתן גם לחתוך תחילת משותף dactylopodite או פשוט נעצרה עם פינצטה בסדר. עצב זה הרגל העיקרי ולעתים כלי דם הקשורים ברור כעת ניתן משכו בעדינות לכל אורך של שריר פותחן בכיוון הפרוקסימלי ולאחר מכן לחתוך משם.

איור 18

עכשיו השריר פותחן חשוף ללא כל רקמת להשיג בדרך של אלקטרודה תאיים או אלקטרודה macropatch מוקד.

איור 19

על מנת לגרות את עצבי הגירוי לשריר פותחן הכנה מועבר כעת לתא הקלטה נועד עם אלקטרודה יניקה פלסטיק. לאחר האלקטרודה מגרה שנבנה לתוך תא נמנע הצורך להשתמש micromanipulator למקום אלקטרודה מגרה. פין הכנת מטה בצלחת הקלטה במקום סניף של עצב המכיל את עצב מעוררים האלקטרודה יניקה.

איור 20

איור 21

(נלקח מתוך: Mykles, DL, Medler, SA, Koenders, א, ו - קופר, RL (2002) Myofibrillar ביטוי איזופורם חלבון קשורה עם יעילות הסינפטית בסיבים איטי של טופר ו פותחן שרירי הרגל של סרטנים ולובסטרים Journal of. Experimental Biology 205 (4): 513-522).

מלוח

ההכנות גזור נשמרות סרטנים מלוחים, פתרון ואן שונה של Harreveld (במ"מ: 205 NaCl, KCl 5.3, 13.5 CaCl2.2H2O; 2.45 MgCl2.6H2O; 5 HEPES מותאם pH 7.4).

הקלטה EPSPs תאיים

כדי לעורר תגובה עורר, האקסון הוא מעורר על ידי גירוי סלקטיבי ממריץ גראס. האזור של שריר פותחן היא משופדת עם אלקטרודה חד תאיים (20-30 התנגדות mOhm) מלא 3M KCl. בשלב ראש סטנדרטיים מגבר הקלטה תאיים ניתן להשתמש, אך השתמשנו במודל Axonclamp 2B (התקנים מולקולריים, בסאניווייל, קליפורניה, ארה"ב) מגבר ו 1 X שלב LU הראש. סיוע לטווח קצר (STF) או סוג אחר של תגובות שונות הרצוי ניתן להשיג על ידי שינוי תנאי גירוי. STF מתקבל על ידי מתן רכבת של 10 או 20 פעימות ב 10 או 20 מרווחי השני, בהתאמה, על עצב מעוררים. תדירות של גירוי בתוך הרכבת יכולים להיות מגוונים (40, 60 ו - 80 הרץ). סופיתהקלטות EPSP acellular מבוצעים באופן שגרתי על ידי הליכים אלה סטנדרטי (Crider & Cooper, 1999, 2000;. Cooper et al 1995b; דוד 'ל, 1983; ניצוצות וקופר, 2004; דסאי, השאה קופר, 2009).

השריר פותחן מחולק לשלושה אזורים כללי: דיסטלי, מרכזי הפרוקסימלי. אף שריר פתוח כולו מעוצבבים על ידי מנוע נוירון יחיד, NMJs הם שונים מבחינה מבנית יש הבדלים מסוימים האזורי יעילות הסינפטית בשלושת האזורים כללי (Cooper et al. 1995a, b). סיב שריר סוג פנוטיפ כן הוכח להיות שונה באזורים אלה (Mykles et al. 2002). מסיבות אלה, הסיבים דיסטלי ביותר משמשים, שכן הם נפתחות בקלות על עקביות בין ההכנות.

איור 22

הקלטה EPSPs quantal מוקד ישירות על אזורים זיהוי של המסוף עצב

ורידים הסינפטי הם דמיינו עם צבע החיוני 4-Di-2-ASP (Magrassi et al., 1987), אשר אינו משפיע על ההולכה הסינפטית, בכל הריכוזים ושעות מועסקים (5 מיקרומטר, 5 דק 'טיפול, קופר ואח' ., 1995b). באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לומן של האלקטרודה המאקרו תיקון הקלטה (Cooper et al, 1995c,.. סנט ¨ hmer et al, 1983) יכול להיות ממוקם ישירות מעל varicosity מבודד אחד. כדי לעורר את מסוף עצב, עצב מוטורי מעוררים מגורה כאמור לעיל. התגובות quantal ספונטנית כמו גם עוררו ניתן להקליט לאורך המחרוזת של ורידים דמיינו, על ידי מעדנות את לומן והעלאת אותו מעל כל varicosity.

הפוטנציאל הסינפטי נרשמות באמצעות אלקטרודה המאקרו תיקון מהותי כפי שתואר על ידי דוד 'ל, 1981; Wojtowicz et al. (1991) ו Mallart (1993). Kimax זכוכית (קוטר חיצוני: 1.5 מ"מ) היה משך אש מלוטש לייצר טיפים תיקון בקטרים ​​הנעים בתוך 10-20 מיקרומטר. לומן של האלקטרודה מלא המדיום ים. מגבר הוא זהה לזה המשמש את ההקלטות תאיים שהוזכרו לעיל. אלקטרודה והתנגדות חותם ניתן לקבוע על ידי העברת פולסים המבחן הנוכחי דרך האלקטרודה. התנגדויות חותם נע בין 0.3 ל 1.0 M0hm ואת התנגדות אלקטרודה נע בין 0.5-1.0 M.0. התנגדות חותם ניתן לנטר ברחבי ההקלטה.

ספירה ישירה של אירועים quantal אפשרי עם תדרי גירוי נמוך. עבור כל תשובה עורר, במספר האירועים quantal ניתן לקבוע. עבור סדרה של תגובות, מספרים הכולל של האירועים quantal נספרים אז להעריך תוכן quantal אומר בהתבסס על סעיפים אלה ישירות. גישה אחת כדי לחשב ממוצע תוכן quantal הוא לוקח את המספר הכולל של הקוונטים ולחלק במספר הכולל של התגובות (דל קסטילו וכץ, 1954). ישנן גישות אחרות אפשר להשתמש מבוסס גם על משרעת השיא או באזור של EPSPs (Cooper et al. 1995b).

References

  1. Atwood, H. L. γ -aminobutyric acid and crab muscle fibres. Experientia (Basel). 20, 161-163 (1964).
  2. Atwood, H. L. Variation in physiological properties of crustacean motor synapses. Nature. 215, 58-58 (1967).
  3. Atwood, H. L. An attempt to account for the diversity of crustacean muscles. Am. Zool. 13, 357-378 (1973).
  4. Atwood, H. L. Organization and synaptic physiology of crustacean neuromuscular systems. Prog. Neurobiol. 7, 291-391 Forthcoming.
  5. Atwood, H. L. Synapses and neurotransmitters. The Biology of Crustacea. Sandeman, H. L., Atwood, D. C. 3, Academic Press, Inc. New York. 105-150 (1982).
  6. Atwood, H. L., Cooper, R. L. Functional and structural parallels in crustaceans and Drosophila neuromuscular systems. Am. Zool. 35, 556-565 (1995).
  7. Atwood, H. L., Cooper, R. L. Assessing ultrastructure of crustacean and insect neuromuscular junctions. J. Neurosci. Meth. 69, 58-58 (1996).
  8. Atwood, H. L., Cooper, R. L. Synaptic diversity and differentiation: Crustacean neuromuscular junctions. Invertebrate Neurosci. 1, 291-307 (1996).
  9. Atwood, H. L., Cooper, R. L., Wojtowicz, J. M. Non-uniformity and plasticity of quantal release at crustacean motor nerve terminals. Advances in Second Messenger and Phosphoprotein Research. Molecular and Cellular Mechanisms of Neurotransmitter Release. Stjärne, L., Greengard, P., Grillner, S. E., Hökfelt, T. G. M., Ottoson, D. R. Raven Press. New York. 363-382 (1994).
  10. Atwood, H. L., Nguyen, P. V., Mercier, A. J. Activity-dependent adaptation in neuromuscular systems: comparative observations. Plasticity of Motoneural Connections. Elsevier. 101-114 (1991).
  11. Bazemore, A., Elliott, K. A. C., Florey, E. Factor I and γ -aminobutyric acid. Nature. 178, 1052-1053 (1956).
  12. Bazemore, A. W., Elliott, K. A. C., Florey, E. Isolation of Factor I. J. Neurochem. 1, 334-339 (1957).
  13. Biedermann, W. Beiträge zur allgemeinen Nerven- und Muskelphysiologie. Zwanzigste Mittheilung. über die Innervation der Krebsschere. Sitz. Berlin D. Akad. Wiss. Wien, Math. Naturwiss. Kl. Abt. III. 95, 7-40 (1887).
  14. Bittner, G. D. Differentiation of nerve terminals in the crayfish opener muscle and its functional significance. J. Gen. Physiol. 51, 731-758 (1968).
  15. Bittner, G. D. The differentiation of crayfish muscle fibers during development. J. Exp. Zool. 167, 439-456 (1968).
  16. Bittner, G. D., Sewell, V. L. Facilitation at crayfish neuromuscular junctions. J. Comp. Neurol. 109, 287-308 (1976).
  17. Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232, 357-374 (1973).
  18. Boistel, J., Fatt, P. Membrane permeability change during inhibitory transmitter action in crustacean muscle. J. Physiol. 144, 176-191 (1958).
  19. Cooper, R. L., Dönmezer, A., Shearer, J. Intrinsic differences in sensitivity to 5-HT between high- and low-output terminals innervating the same target. Neuroscience Research. 45, 163-172 (2003).
  20. Cooper, R. L., Hampson, D., Atwood, H. L. Synaptotagmin like expression in the motor nerve terminals of crayfish. Brain Res. 703, 214-216 (1995).
  21. Cooper, R. L., Harrington, C. C., Marin, L., Atwood, H. L. Quantal release at visualized terminals of a crayfish motor axon: Intraterminal and regional differences. J. Comp. Neurol. 375, 583-600 (1996).
  22. Cooper, R. L., Marin, L., Atwood, H. L. Synaptic differentiation of a single motor neuron: Conjoint definition of transmitter release, presynaptic calcium signals and ultrastructure. J. Neurosci. 15, 4209-4222 (1995).
  23. Cooper, R. L., Stewart, B. A., Wojtowicz, J. M., Wang, S., Atwood, H. L. Quantal measurement and analysis methods compared for crayfish and Drosophila neuromuscular junctions and rat hippocampus. J. Neurosci. Meth. 61, 67-79 (1995).
  24. Cooper, R. L., Winslow, J., Govind, C. K., Atwood, H. L. Synaptic structural complexity as a factor enhancing probability of calcium mediated transmitter release. J. Neurophysiol. 75, 2451-2466 (1996).
  25. Crider, M. E., Cooper, R. L. The importance of the stimulation paradigm in determining facilitation and effects of neuromodulation. Brain Research. 842, 324-331 (1999).
  26. Crider, M. E., Cooper, R. L. Differentially facilitation of high- and low-output nerve terminals from a single motor neuron. J. of Applied Physiology. 88, 987-996 (2000).
  27. Del Castillo, J., Katz, B. Quantal components of the end-plate potential. J. Physiol. (Lond). 124, 573-57 (1954).
  28. Desai-Shah, M., Cooper, R. L. Different mechanisms of Ca2+ regulation that influence synaptic transmission: comparison between Crayfish and Drosophila NMJs. SYNAPSE. In Press (2009).
  29. Desai-Shah, M., Viele, K., Sparks, G., Nadolski, J., Hayden, B., Srinivasan, V. K., Cooper, R. L. Assessment of synaptic function during short-term facilitation in motor nerve terminals in the crayfish. Open Neurosci. J. 2, 24-35 (2008).
  30. Dropic, A. J., Brailoiu, E., Cooper, R. L. Presynaptic mechanism of action induced by 5-HT in nerve terminals: Possible involvement of ryanodine and IP3 sensitive Ca2+ stores. Comp. Biochem. Phys. A. 142, 355-361 (2005).
  31. Dudel, J. Presynaptic inhibition of the excitatory nerve terminal in the neuromuscular junction of the crayfish. Pflügers Arch. ges. Physiol. 277, 537-557 (1963).
  32. Dudel, J. The mechanism of presynaptic inhibition at the crayfish neuromuscular junction. Pflügers Arch. 284, 66-80 (1965).
  33. Dudel, J. Potential changes in the crayfish motor nerve terminal during repetitive stimulation. Pflügers Arch. 282, 323-337 (1965).
  34. Dudel, J. Graded or all-or-nothing release of transmitter quanta by local depolarization of nerve terminals on crayfish muscle. Pflügers Arch. 398, 155-164 (1983).
  35. Dudel, J. Calcium dependence of quantal release triggered by graded depolarization pulses to nerve terminals on crayfish and frog muscle. Pflügers Arch. 415, 289-298 (1989).
  36. Dudel, J. Shifts in the voltage dependence of synaptic release due to changes in the extracellular calcium concentration at nerve terminals on muscle of crayfish and frogs. Pflügers Arch. 415, 299-303 (1989).
  37. Dudel, J. Calcium and depolarization dependence of twin-pulse facilitation of synaptic release at nerve terminal of crayfish and frog muscle. Pflügers Arch. 415, 304-309 (1989).
  38. Dudel, J. Twin pulse facilitation in dependence on pulse duration and calcium concentration at motor nerve terminals of crayfish and frog. Pflügers Arch. 415, 310-315 (1989).
  39. Dudel, J. The effect of reduced calcium on quantal unit current and release at the crayfish neuromuscular junction. Pflügers Arch. 391, 35-40 (1981).
  40. Dudel, J., Franke, C., Hatt, H. Rapid activation and desensitization of transmitter-liganded receptor channels by pulses of agonists. Ion Channels. Narahashi, T. 3, Plenum Press. New York. 207-260 (1992).
  41. Dudel, J., Kuffler, S. W. The quantal nature of transmission and spontaneous miniature potentials at the crayfish neuromuscular junction. J. Physiol. (Lond). 155, 529-52 (1961).
  42. Dudel, J., Parnas, I., Parnas, H. Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish muscle. VI. Release determined by both intracellular calcium concentration and depolarization of the nerve terminal. Pflügers Arch. 399, 1-10 (1983).
  43. Fatt, P., Katz, B. Distributed 'endplate potentials' of crustacean muscle fibres. J. exp. Biol. 30, 433-439 (1953).
  44. Florey, E., Cahill, M. A. The innervation pattern of crustacean skeletal muscle. Cell Tissue Res. 224, 527-541 (1982).
  45. Govind, C. K., Pearce, J., Wojtowicz, J. M., Atwood, H. L. Strong and weak synaptic differentiation in the crayfish opener muscle: structural correlates. Synapse. 16, 45-58 (1994).
  46. Günzel, D., Galler, S., Rathamayer, W. Fibre heterogeneity in the closer and opener muscles of the crayfish walking legs. J. Exp. Biol. 175, 267-281 (1993).
  47. He, P., Southard, R. C., Whiteheart, S. W., Cooper, R. L. Role of alpha-SNAP in promoting efficient neurotransmission at the crayfish neuromuscular junction. J. Neurophysiol. 82, 3406-3416 (1999).
  48. Hochner, B., Parnas, H., Parnas, I. Membrane depolarization evokes neurotransmitter release in the absence of calcium entry. Nature. 342, (6248), 433-435 (1989).
  49. Huxley, T. H. The crayfish an introduction to the study of zoology. Series Landmarks of Science. C. Kegan Paul. London. (1880).
  50. Iravani, J. Membrandepolarisation der Muskelfasern des öffnermuskels des Flusskrebses auf Nervenreiz und Kaliumapplikation. Experientia. 21, 609-610 (1965).
  51. Jahromi, S. S., Atwood, H. L. Three-dimensional ultrastructure of the crayfish neuromuscular apparatus. J Cell Biol. 63, 599-613 (1974).
  52. Katz, B. Neuro-muscular transmission in invertebrates. Biol. Rev. 24, 1-20 (1949).
  53. Katz, B., Kuffler, S. W. Excitation of the nerve-muscle system in crustacea. Proc. R. Soc. Lond. B. 133, 374-389 (1946).
  54. Katz, P. S., Kirk, M. D., Govind, C. K. Facilitation and depression at different branches of the same motor axon: evidence for presynaptic differences in release. J. Neurosci. 13, (7), 3075-3089 (1993).
  55. Kerkut, G. A., Leake, L. D., Shapira, A., Cowan, S., Walker, R. J. The presence of glutamate in nerve-muscle perfusates of Helix. Carcinus and Periplaneta. Comp Biochem Physiol. 15, (4), 485-502 (1965).
  56. Kravitz, E. A. Enzymic formation of gamma-aminobutyric acid in the peripheral and central nervous system of lobsters. J Neurochem. 9, 363-370 (1962).
  57. Kravitz, E. A., Kuffler, S. W., Potter, D. D., Vangelder, N. M. Gamma-aminobutyric acid and other blocking compounds in Crustacea. II. Peripheral nervous system. J. Neurophysiol. 26, 729-738 (1963).
  58. Kravitz, E. A., Kuffler, S. W., Potter, D. D. Gamma-aminobutyric acid and other blocking compounds in Crustacea. III. Their relative concentrations in separated motor and inhibitory axons. J Neurophysiol. 26, 751-75 (1963).
  59. Kravitz, E. A., Molinoff, P. B., Hall, Z. W. A comparison of the enzymes and substrates of gamma-aminobutyric acid metabolism in lobster excitatory and inhibitory axons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 54, 778-782 (1965).
  60. Kravitz, E. A., Potter, D. D. A further study of the distribution of -aminobutyric acid between excitatory and inhibitory axons of the lobster. J. Neurochem. 12, 323-328 (1965).
  61. Lancaster, M., Viele, K., Johnstone, A. F. M., Cooper, R. L. Automated classification of evoked quantal events. J. Neurosci. Meth. 159, 325-336 (2007).
  62. Lnenicka, G. A., Mellon, D. Jr Changes in electrical properties and quantal current during growth of identified muscle fibres in the crayfish. J. Physiol. 345, 261-284 (1983).
  63. Linder, T. M. The accumulative properties of facilitation at crayfish neuromuscular synapses. J. Physiol., Lond. 238, 223-234 (1974).
  64. Ling, G., Gerard, R. W. The normal membrane potential of frog sartorius fibers. J. Cell. Comp. Physiol. 34, 383-396 (1949).
  65. Logsdon, S., Johnstone, A. F. M., Viele, K., Cooper, R. L. The regulation of synaptic vesicles pools within motor nerve terminals during short-term facilitation and neuromodulation. J. Applied Physiol. 100, 662-671 (2005).
  66. Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent probes that stain living nerve terminals. J. Neurosci. 7, 1207-1214 (1987).
  67. Mallart, A. Calcium dependent modulation of the facilitation of transmitter release at neuromuscular junctions of Drosophila. J. Physiol. (Paris). 87, 83-88 (1993).
  68. Mulkey, R. M., Zucker, R. S. Action potentials must admit calcium to evoke transmitter release. Nature. 350, 152-155 (1991).
  69. Mulkey, R. M., Zucker, R. S. Calcium released by photolysis of DM-nitrophen triggers transmitter release at the crayfish neuromuscular junction. J. Physiol. 462, 243-260 (1993).
  70. Mykles, D. L., Medler, S. A., Koenders, A., Cooper, R. L. Myofibrillar protein isoform expression is correlated with synaptic efficacy in slow fibres of the claw and leg opener muscles of crayfish and lobster. J. Exp. Bio. 205, 513-522 (2002).
  71. Nudell, B. M., Grinnell, A. D. Regulation of synaptic position, size, and strength in anuran skeletal muscle. J Neurosci. 3, (1), 161-176 (1983).
  72. Parnas, H., Dudel, J., Parnas, I. Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish. I. Saturation kinetics of release and of entry and removal of calcium. Pflügers Arch. 393, 1-14 (1982).
  73. Parnas, I., Parnas, H., Dudel, J. Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish muscle. II. Duration of facilitation and removal processes of calcium from the terminal. Pflügers Arch. 393, 323-326 (1982).
  74. Parnas, H., Dudel, J., Parnas, I. Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish. IV. The effect of Mg2+ ions on the duration of facilitation. Pflügers Arch. 395, 1-5 (1982).
  75. Parnas, I., Parnas, H., Dudel, J. Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish muscle. V. Basis for synapse differentiation of the fast and slow type in one axon. Pflügers Arch. 395, 261-270 (1982).
  76. Robbins, J. The excitation and inhibition of crustacean muscle by amino acids. J. Physiol. 148, 39-50 (1959).
  77. Richet, C. Contribution a la physiologic des centres nerveux et des muscles de l'ecrevisse. Arch. de Physiol. 6, 263-523 (1879).
  78. Physiologie des muscles et des nerfs. Le ons prof sees la Facult de m decine en 1881, par Charles Richet. Paris, G. Bailli re. (1881).
  79. Ringer, S. Regarding the action of hydrate of soda, hydrate of ammonia, and hydrate of potash on the ventricle of the frog's heart. J. Physiol. 3, 195-202 (1882).
  80. Ringer, S. Concerning the influence exerted by each of the constituents of the blood on the contraction of the ventricle. J. Physiol. 3, 380-393 (1882).
  81. Ruffner, M. E., Cromarty, S. I., Cooper, R. L. Depression of synaptic efficacy in Drosophila neuromuscular junctions by the molting hormone (20-Hydroxyecdysone). J. Neurophysiol. 81, 788-794 (1999).
  82. Sherman, R. G., Atwood, H. L. Synaptic facilitation: Long term neuromuscular facilitation in crustaceans. Science. 171, 1248-1250 (1971).
  83. Sherman, R. G., Atwood, H. L. Correlated electrophysiological and ultrastructural studies of a crustacean motor unit. J. Gen. Physiol. 59, 586-615 (1972).
  84. Sparks, G., Cooper, R. L. 5-HT offsets homeostasis of synaptic transmission during short-term facilitation. J. Applied Physiol. 96, 1681-1690 (2004).
  85. Sparks, G. M., Dasari, S., Cooper, R. L. Actions of MDMA at glutamatergic neuromuscular junctions. Neurosci. Res. 48, 431-438 (2004).
  86. Sparks, G. M., Brailoiu, E., Brailoiu, C., Dun, N. J., Tabor, J., Cooper, R. L. Effects of m-CPP in altering neuronal function: Blocking depolarization in invertebrate motor & sensory neurons but exciting rat sensory neurons. Brain Res. 969, 14-26 (2003).
  87. Southard, R. C., Haggard, J., Crider, M. E., Whiteheart, S. W., Cooper, R. L. Influence of serotonin on the kinetics of vesicular release. Brain Res. 871, 16-28 (2000).
  88. Stühmer, W., Roberts, W. S., Almers, W. The loose patch clamp. Single channel recordings. Sakmann, B., Neher, E. Plenum Press. New York. 123-132 (1983).
  89. Tabor, J., Cooper, R. L. Physiologically identified 5-HT2 -like receptors at the crayfish neuromuscular junction. Brain Res. 932, 91-98 (2002).
  90. Van Harreveld, A., Mendelson, M. Glutamate-induced contractions in crustacean muscle. J. Cell Comp. Physiol. 54, 85-94 (1959).
  91. Van Harreveld, A. A physiological solution for freshwater crustaceans. Proc. Soc Exp. Biol. Med. 34, 428-432 (1936).
  92. Van Harreveld, A., Wiersma, C. A. G. The Triple Innervation of the Crayfish Muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 22, (11), 667 (1936).
  93. Viele, K., Lancaster, M., Cooper, R. L. The self-modeling structure of evoked post-synaptic potentials. Synapse. 60, 32-44 (2006).
  94. Viele, K., Stromberg, A., Cooper, R. L. Determining the number of release sites within the nerve terminal by statistical analysis of synaptic current characteristics. Synapse. 47, 15-25 (2003).
  95. Vyshedskiy, A., Lin, J. -W. Study of the inhibitor of the crayfish neuromuscular junction by presynaptic voltage control. J. Neurophysiol. 77, 103-115 (1997).
  96. Vyshedskiy, A., Lin, J. -W. Activation and detection of facilitation as studied by presynaptic voltage control at the inhibitor of the crayfish opener muscle. J. Neurophysiol. 77, 2300-2315 (1997).
  97. Vyshedskiy, A., Lin, J. -W. Change of transmitter release kinetics during facilitation revealed by prolong test pulses at the inhibitor of the crayfish opener muscle. J. Neurophysiol. 78, 1791-1799 (1997).
  98. Wiersma, C. A. G. Synaptic facilitation in the crayfish. J. Neurophysiol. 12, 267-275 (1949).
  99. Winslow, J. L., Duffy, S. N., Charlton, M. P. Homosynaptic facilitation of transmitter release in crayfish is not affected by mobile calcium chelators: implications for the residual ionized calcium hypothesis from electrophysiological and computational analyses. J. Neurophysiol. 72, 1769-1793 (1994).
  100. Winslow, J. L., Cooper, R. L., Atwood, H. L. Sodium in presynaptic nerve terminals in response to stimulation. J. Neurosci. Meth. 118, 163-175 (2002).
  101. Wojtowicz, J. M., Smith, B. R., Atwood, H. L. Activity-dependent recruitment of silent synapses. Ann. NY Acad. Sci. 627, 169-179 (1991).
  102. Zucker, R. S. Changes in the statistics of transmitter release during facilitation. J. Physiol., Lond. 229, 787-810 (1973).
  103. Zucker, R. S. Crayfish neuromuscular facilitation activated by constant presynaptic action potentials and depolarizing pulses. J. Physiol. (Lond). 241, 69-89 (1974).
  104. Zucker, R. S. Characteristics of crayfish neuromuscular facilitation and their calcium dependence. J. Physiol., Lond. 241, 91-110 (1974).
  105. Zucker, R. S., Haydon, P. G. Membrane potential has no direct role in evoking neurotransmitter release. Nature. 335, 360-362 (1988).
צפה היסטורי הפגנה לפיזיולוגיה NMJ של השריר פותחן סרטן הנהרות
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Cooper, A. S., Cooper, R. L. Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle. J. Vis. Exp. (33), e1595, doi:10.3791/1595 (2009).More

Cooper, A. S., Cooper, R. L. Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle. J. Vis. Exp. (33), e1595, doi:10.3791/1595 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter