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Biology

Vedi storici e dimostrazione di Fisiologia presso la NMJ del Muscolo Opener gamberi di fiume

doi: 10.3791/1595 Published: November 9, 2009

Summary

Il muscolo della gamba opener gambero viene presentato per la sua importanza storica e la versatilità sperimentale nel fenotipo muscolare, la fisiologia e la plasticità sinaptica.

Abstract

Qui vi presentiamo alcune delle principali scoperte importanti fatte con l'apertura neuromuscolare (NMJ) preparazione di crostacei e dimostrano che c'è ancora molto da imparare da questa preparazione modello. Nella comprensione della storia si può capire perché ancora oggi questo NMJ offre ancora un parco giochi ricco di rivolgere domande riguardanti la funzione di pre-e post-sinaptica e la plasticità. La vitalità e la facilità di accesso al terminale per intracellulare e extracellulare elettrofisiologia e di imaging sono vantaggi significativi. I meccanismi alla base della modulazione della cinetica vescicolare e la fusione entro i terminali ad alta e bassa resa sono mendicare per le indagini. La preparazione offre anche un sistema verificabile modello di calcolo per le valutazioni e le manipolazioni di esaminare le variabili chiave nei modelli teorici della funzione sinaptica, per esempio la dinamica di calcio durante la facilitazione a breve termine. La complessità sinaptica della zona attiva e la natura statistica di rilascio quantale è anche uno spazio aperto per la ricerca futura sia sperimentale e computazionale.

Protocol

Introduzione

Le giunzioni neuromuscolari dei crostacei hanno fornito importanti contributi alla fisiologia ed in particolare alla fisiologia sinaptica nel corso degli anni. La facilità di dissezione e la vitalità sono probabilmente i fattori chiave che hanno promosso all'inizio del fisiologo anatomista e successivamente di utilizzare crostacei come preparazioni sperimentali. Gamberi in particolare, sono facilmente ottenibili da più ruscelli d'acqua dolce e laghi così come sono facili da mantenere in un ambiente di laboratorio, rispetto ai crostacei, che richiedono un raffreddore, ambiente acqua salata.

Un zoologo alla fine degli anni 1800, prese a cuore in particolare delle specie di crostacei (ad esempio, gamberi) e scrisse un libro intitolato Il Gambero ( TH Huxley , 1879). Questo testo è servita come guida su questi organismi per anni e ancora oggi è salutato come un libro completo selettivamente sui gamberi che fare con la storia della vita, l'anatomia e la fisiologia. Huxley visto il gambero di fiume come un modello animale di immergersi nelle profondità di zoologia in tutti gli aspetti, quindi, la natura globale del suo libro. La tempistica è stata vantaggiosa fisiologia era fiorente alla fine del 1880 con la comprensione di Ringer di ioni necessari per il mantenimento preparati cuore di rana (Ringer, 1882a, b). Questo è probabilmente uno dei motivi che gli esperimenti fisiologici progredito rapidamente in altre specie come il gambero di fiume. Inoltre, una soluzione salina per mantenere la preparazione di crostacei erano stati descritti da van Harreveld nel 1936.

Sorprendentemente l'innervazione del muscolo apertura delle gambe gamberi anche essere caratterizzata in questo periodo nella storia (Biedermann, 1887). Ma ancora più sorprendente è che gli studi fisiologici erano già in corso nei muscoli del gambero da Charles Richet in Francia. Infatti, gli esperimenti in gamberi potrebbero eventualmente essere i primi a dimostrare facilitazione al neuromuscolare (NMJ) (Richet, 1879; anche vedere Richet, 1881). Nel corso dei prossimi decenni NMJs gamberi venivano descritti anatomicamente e fisiologicamente in relazione allo sviluppo della tensione e anatomia (Van Harreveld e Wiersma, 1936).

L'avvento di registrazione intracellulare, con elettrodi taglienti (Ling e Gerard, 1949), rivitalizzato il campo per affrontare diverse serie di domande. Muscoli crostacei erano noti per produrre contrazioni graduate (Katz & Kuffler 1946; Katz, 1949; Wiersma, 1949), ma non è stato fino al 1953 che Fatt e Katz registrato potenziale transmembrana di facilitazione a breve termine nelle fibre muscolari granchio.

Il muscolo apertura degli arti di gambero è stato nuovamente messo in evidenza nel 1961 quando Dudel e Kuffler dimostrato facilitazione in questo muscolo e ha mostrato per il 1 ° tempo i fenomeni di inibizione presinaptica (1961a, b; Dudel, 1963, 1965a). Essi hanno inoltre riferito sulla natura quantica della trasmissione sinaptica a questo NMJ (1961b). Negli ultimi 50 anni c'è stato un po 'di attenzione per la preparazione e le varie tecniche utilizzate per monitorare fisiologia sinaptica. Per una breve visione di oltre indagini utilizzando questa preparazione, si comincia con il notare che l'intero muscolo è innervato da un eccitatorie e inibitorie un assone che potrebbe essere selettivamente stimolati. Atwood (1964) ha dimostrato con i treni di stimolazione dei potenziali eccitatori post-sinaptici facilitato e prodotto la tensione muscolare. Iravani (1965) riportato sulle differenze regionali nelle risposte sinaptica a seconda della regione del muscolo. Poco dopo Dudel (1965a, b) hanno registrato i potenziali lungo le terminazioni nervose sulla apertura e dimostrato che la trasmissione sinaptica della serotonina neuromodulatore migliorato aumentando tenore medio quantico.

A questo punto è stato stabilito che i muscoli crostaceo risposto al glutammato e vari aminoacidi e GABA (Van Harreveld e Mendelson, 1959; Robbins, 1959;. Kerkut et al, 1965). Le risposte inibitorio del GABA è stato identificato da Florey (Bazemore et al., 1956, 1957) e altri (Boistel e Fatt, 1958). Più tardi GABA è stato isolato e confermato da Kravtiz (Kravitz e Potter, 1965; Kravitz et al, 1963a, b;. Kravitz, 1962) dagli assoni dei preparativi opener aragosta.

I muscoli gamberi offerto non solo preparati facilmente accessibili, ma consente di studiare come singoli neuroni motori identificabili può portare a diverse risposte postsinaptica ad un livello fisiologico e strutturale. In particolare il muscolo opener è innervato da un singolo neurone motore eccitatori, ma il potenziale eccitatorio postsinaptico (EPSPS) su posizioni diverse può variare più di 50 volte della dorsale delle fibre superficiali (Bittner, 1968a, b) e fino a 8 volte in superficiale ventrale fibre (Iravani, 1965).

"> Con il seminale scoprire che il NMJ opener in gamberi esposto a lungo termine facilitazione (LTF) (Sherman e Atwood, 1971), oltre a breve termine facilitazione, le basi meccanicistiche per questi fenomeni da affrontare. Come un lato nota, potenziamento a lungo termine (LTP) è stato scoperto nel cervello dei vertebrati due anni dopo (Bliss e L mo, 1973) senza citazione alla scoperta originale del fenomeno al NMJ gambero di fiume. Da questo periodo molti ricercatori focalizzati sugli attributi di STF e LTF utilizzando il NMJ apertura di gamberi per studiare i meccanismi cellulari (Atwood, 1973, 1976, 1982; Atwood et al, 1994;. Zucker, 1973, 1974a, b; Bittner e Sewell, 1976;. Parnas et al, 1982a, b, c, d; Dudel et al, 1983;.. Vyshedskiy e Lin, 1997a, b, c) anche un punto di attenzione è stato quello di capire come un singolo neurone motore innervano varie fibre muscolari del muscolo apriscatole dar luogo a tali risposte diverse sinaptica (Linder, 1974; G ° nzel et al, 1993;. Govind et al, 1994;. Iravani, 1965; Atwood, 1967; Bittner, 1968a, b; Sherman e Atwood, 1972; Zucker, 1974a; Parnas et al, 1982a;. Zucker e Haydon, 1988; Dudel, 1989a, b, c, d).

Struttura sinaptica per tenere conto delle risposte differenziale sinaptica può essere studiata tramite l'analisi ultrastrutturale (Jahromi e Atwood, 1974). Le misure di differenze ionica a causa di attività è in grado di essere indagato con iniezioni assonale di Ca2 + e Na + indicatori, nonché Ca2 + buffers (Mulkey e Zucker 1993;. Winslow et al, 2002), e questi flussi possono essere modellati all'interno del terminal (Winslow et al, 1994;. Cooper et al, 1996b).. Adattamenti attività dipendente (Atwood et al, 1991). Farmacologico e l'identificazione dei sottotipi di recettori neuromodulatore (Dropic et al, 2005;. Ruffner et al, 1999;. Sparks e Cooper, 2004; Sparks et al, 2004;. Tabor e Cooper , 2002;) che influenzano le piscine delle vescicole sinaptiche e cinetica (Logsdon et al, 2005;. Southard et al, 2000;.. Sparks et al, 2003) è stato anche esaminato, che sta aprendo la strada a nuovi interrogativi da affrontare. I concetti di ruolo di calcio durante STF contro depolarizzazione della membrana nella trasmissione sinaptica alla NMJ opener comportare alcune differenze di opinione (Mulkey e Zucker, 1991; HÖCHNER et al, 1989).

In tempi relativamente recenti la differenziazione regionale in forza sinaptica e facilitazione dal singolo motoneurone, è stato affrontato e sembra essere dovuto a differenze rispetto locali cambiamenti presinaptici nella struttura sinaptica e fisiologia (Atwood et al, 1994;. Atwood e Cooper, 1995, 1996a , b; Cooper et al, 1995b, 1996a, b).. Analisi ultrastrutturale da elettrone studi micrografica ha dimostrato che la varicosità contengono la maggior parte dei contatti sinaptici (Florey e Cahill, 1982;. Cooper et al, 1995b). La forza della trasmissione sinaptica diminuisce lungo la lunghezza di un unico terminale che sembra essere dovuto alla complessità della struttura sinaptica (Cooper et al, 1996a;.. Govind et al, 1994). Le differenze nella struttura sinaptica può in parte spiegare le differenze nel Ca2 + durante la stimolazione a frequenze diverse (Cooper et al. 1995b, 1996b).

Poiché ci sono differenze regionali nella fenotipo muscolare e biochimica tra le fibre muscolari del opener (G ° nzel, et al, 1993;.. Mykles et al, 2002) che sono divisi in regioni, potrebbe spiegare un fenotipo muscolare evolutivamente regolamentato e che influenze e mantiene le differenze regionali del neurone motore (Mykles et al., 2002). L'idea di influenze retrograde è stato studiato in rana muscolo scheletrico (Nudell e Grinnell, 1983), nel aragosta (Katz et al., 1993), e gamberi (Lnenicka e Mellon, 1983) con ragionevoli prove convincenti. Il regolamento locale di terminali in un singolo neurone, senza influenzare gli altri terminali è spazialmente tutto possibile in crostaceo motoneuroni, perché i terminali in grado di misurare da 1cm a 10 cm di distanza l'uno dall'altro. A differenza dei vertebrati, una unità motoria può includere più di un muscolo in invertebrati (vedi recensione di Atwood, 1973). Il neurone excitor motore che innerva l'intero muscolo opener innerva anche il muscolo barella in un segmento gamba più prossimale. Misure di agevolazione tra le fibre muscolari del muscolo opener ha mostrato che ci sono differenze che possono essere correlati a livelli di riposo a ioni Ca2 + (Cooper et al. 2005b) e / o, eventualmente, cooperativa di rilascio (Parnas et al. 1982a, b)

Le differenze nella complessità strutturale tra sinapsi ad alta e bassa resa lungo i terminali sul muscolo apertura sono stati indagati per le firme quantico rispetto al reclutamento di Active zone tra sinapsi durante la STF, ma questo ha dimostrato di essere difficile da accertare (Lancaster et al, 2007;. Viele et al, 2003, 2006.). Possibili le piscine di vescicole tra sinapsi ad alta e bassa resa si rivelerà essere regolata in modo differenziato in cinetica, come è noto neromodulators avere effetti differenziale sui terminali a basso e ad alto rendimento (Logsdon et al, 2005;. Sparks e Cooper, 2004; Cooper et al., 2003).

L'utilizzo futuro della preparazione opener muscolare in gamberi di fiume è ricca come è stato 50 o 100 anni fa. La preparazione è ancora molto resistente in confronto a molti altri preparati sinaptica. Quantali risposte possono essere elettrofisiologici registrati direttamente i contatti sinaptici e ripreso per la dinamica delle vescicole in vari tipi di terminali ben definiti. La preparazione non ha perso il suo fascino di avere un'unica neuroni identificabili per gli ingressi eccitatori e inibitori. Nonostante i gamberi non essendo pratici per la manipolazione genetica, gli studi sono possibili per affrontare il ruolo delle proteine ​​sinaptiche come per Drosophila. Ci sono molte somiglianze in funzione sinaptica di Drosophila NMJs (Atwood e Cooper, 1995, 1996a, b) che possono essere esaminati da studi iniezione di proteine ​​(He et al., 1999). Il regolamento di piscine delle vescicole sinaptiche all'interno dei terminali del nervo motore è anche una zona ricca per le indagini future, nonché studi meccanicistici di capire regolazione del calcio durante STF (Desai-Shah et al, 2008;. Desai-Shah e Cooper, 2009) per spiegare molti dei misteri rimasti nei fondamenti della trasmissione sinaptica.

Metodi

Dissezione

Gambero, Procambarus clarkii, che misura 6-10 cm di lunghezza del corpo (Atchafalaya biologica Supply Co., Raceland, LA) sono indotti a automatizzare la gamba prima o la seconda a piedi da pizzicare con forza al segmento ischiopodite.

Figura 1
Girare il piedino intorno fino a quando si può essere sicuri l'esterno (laterale) è rivolto verso l'alto sulla piastra di dissezione. Questo è di solito il lato ad arco alto. Ponendo la gamba su un pezzo di carta velina aiuta così la preparazione può essere trasformata facilmente rendendo questi tagli.

Figura 2

Con un interruttore di lama di bisturi e porta una lama di rasoio affilato è usato per incidere il cuticola fino a poco attraverso il taglio nel modello mostrato in questa figura per il segmento meropodite. La cura deve essere utilizzato a non tagliare troppo lontano distale sulla dorsale di tagliare ventrale dal meropodite - giunto carpopodite. Lascia la cuticola posto per ora.

Figura 3

Figura 4

Con la lama incidere il bisturi sulla cuticola propodite fino a poco attraverso il taglio nel modello mostrato nella figura qui sopra per il segmento propodite da un lato e poi ripetete dall'altro lato unendo i tagli prossimale. La cura deve essere usato non per tagliare nel muscolo opener. Questo può essere fatto tenendo la lama appoggiata al muscolo più vicini quando si taglia attraverso la cuticola. Anche per la dorsale di taglio ventrale, che collega tutto il lato ventrale, fare attenzione a non tagliare troppo prossimale come la connessione comune è stretta e facilmente rotto. Lascia la cuticola posto per ora.

Figura 5

I preparativi dovrebbe essere messo in soluzione salina. Questo piatto dissezione dovrebbe avere un (Dow Corning) Sylgard rivestimento sulla parte inferiore (1 cm di spessore). Il Sylgard è usato in modo che i pin di insetti possono essere bloccati dentro per tenere la preparazione ancora. A questo punto bastone uno spillo in un angolo dorsale caudale, all'interno del taglio, della finestra effettuate nel meropodite.
Con sottile pinzetta (# 5) sollevare leggermente la cuticola dalla fine distale e con il rasoio, tagliare le fibre del muscolo flessore dalla cuticola, tagliando in modo distale a prossimale. Sollevare la finestra di off cuticola.

Figura 6

Figura 7

Ora tagliare il apodeme (tendine) al meropodite - carpopodite comune (vedi sotto). State molto attenti a tirare il tendine lontano dalla cavità gamba prima di effettuare il taglio e tagliare solo il tendine e non il nervo della gamba principale che si trova sul lato interno del tendine. Pizzicare il tendine, dove è stato tagliato con una pinzetta e tirare il muscolo flessore off sollevandola in senso caudale. Ora il nervo della gamba principale e il muscolo estensore sono esposti.

Figura 8

Procedere al segmento propodite e ora tagliato alla dactylop propoditeodite comune. Qui il tendine più vicino forse tagliato dalla attaccamento cuticola. Tirare la ventrale (lato muscolo più vicino) segmento del propodite caudalmente verso il basso e indietro, in modo che il muscolo attaccato nella regione caudale può essere visto. Tagliare questi muscoli con il rasoio. Fare attenzione a non tagliare il muscolo troppo vicino al comune e il rischio di taglio del ramo del nervo motore al muscolo apertura. Il muscolo apertura è ora esposta al salino.

Figura 9

Figura 10

Ritorno alla regione meropodite per isolare i fasci nervosi che contiene i motoneuroni eccitatori e inibitori al muscolo apertura. Nella regione più caudale del segmento meropodite il fascio nervo della gamba di solito contiene un fascio nervo separata. Questo breve regione in cui due fasci si può vedere è dove il fascio dorsale può essere recisi con le forbici fine. Alla fine taglio può essere preso con # 5 pinzette e delicatamente tirato distalmente fino a circa metà della lunghezza del segmento meropodite è raggiunto. Questo ramo del nervo lungo contenente il nervo eccitatorio apertura e il fascio di nervi più grandi contiene i neuroni inibitori motore del muscolo opener.

Figura 11

Figura 12

Figura 13

La preparazione del segmento meropodite ora è tagliato in modo diagonale in modo tale che un perno insetto può essere posizionato attraverso la parte dorsale del meropodite. Questa posizione parte ventrale del muscolo apertura in modo che sia rivolto verso l'osservatore (come illustrato di seguito).

Figura 14

Figura 15

Figura 16

Le fibre residue del muscolo più vicino che blocca la visione del muscolo apertura può essere rimossa premendo le fibre contro la cuticola e fuori della cavità propodite. A volte un tessuto connettivo che copre l'apertura può essere rimosso con attenzione usando il # 5 pinzette. Il nervo della gamba principale che corre lungo il muscolo apertura e va in dactylopodite può essere tagliato in l'inizio del comune dactylopodite o appena tirato su con le pinzette fine. Questo nervo della gamba principali e talvolta il vaso sanguigno ovvio associati possono ora essere tirato leggermente in direzione prossimale per la lunghezza del muscolo apertura e poi tagliare.

Figura 18

Ora il muscolo apertura è esposto senza alcun tessuto per ottenere nel senso di un elettrodo intracellulare o di un elettrodo macropatch focale.

Figura 19

Al fine di stimolare il nervo eccitatori al muscolo apri la preparazione è ora spostato in una camera di registrazione progettato con un elettrodo di aspirazione in plastica. Avendo l'elettrodo stimolante costruita nella camera evita di dover utilizzare un micromanipolatore per posizionare un elettrodo stimolante. Perno la preparazione giù nel piatto e il luogo di registrazione del ramo del nervo che contiene il nervo eccitatorio l'elettrodo di aspirazione.

Figura 20

Figura 21

(Tratto da: Mykles, DL, Medler, SA, Koenders, A., e Cooper, RL (2002) isoforma proteica miofibrillare espressione è correlata con l'efficacia sinaptica in fibre lente del artigli e muscoli delle gambe opener di gamberi e aragosta Journal of. Biologia Sperimentale 205 (4): 513-522).

Salino

Preparati sezionato sono mantenuti in gamberi salina, soluzione una versione modificata di Van Harreveld (in mM: 205 NaCl, 5.3 KCl; 13,5 CaCl2.2H2O; 2,45 MgCl2.6H2O, 5 HEPES portato a pH 7,4).

Registrazione EPSPS intracellulare

Da ottenere una risposta evocata, l'assone eccitatorio è selettivamente stimolato da uno stimolatore Grass. Una regione del muscolo apertura è impalato con tagliente elettrodo intracellulare (20 a 30 mOhm resistenza) riempito con 3 M KCl. Un palco testa di serie e l'amplificatore per la registrazione intracellulare può essere utilizzato, ma abbiamo usato un modello Axonclamp 2B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) amplificatore e 1 X stadio testa LU. Facilitazione a breve termine (STF) o vari altri tipi di risposte desiderate possono essere ottenute variando le condizioni di stimolo. STF si ottiene dando un treno di 10 o 20 impulsi a 10 o intervalli di 20 secondi, rispettivamente, al nervo eccitatori. La frequenza di stimolazione all'interno del treno può essere variata (40, 60 e 80 Hz). Intrregistrazioni EPSP acellulare sono regolarmente eseguite da queste procedure standard (Crider & Cooper, 1999, 2000;. Cooper et al 1995b; Dudel, 1983; Sparks e Cooper, 2004; Desai-Shah e Cooper, 2009).

Il muscolo apertura è suddiviso in tre regioni generale: distali, centrale e prossimale. Anche se l'intero muscolo aperto è innervato da un unico neurone motore, il NMJs sono strutturalmente diversi e hanno specifiche differenze regionali in termini di efficacia sinaptica in queste tre regioni generale (Cooper et al. 1995a, b). La tipologia delle fibre muscolari fenotipo è stato anche dimostrato di essere diversi in queste regioni (Mykles et al. 2002). Per queste ragioni, le fibre più distali sono utilizzati, dal momento che sono facilmente delimitate per la coerenza tra le preparazioni.

Figura 22

Registrazione focale EPSPS quantali direttamente sopra le regioni identificabili del terminale nervoso

Le varicosità sinaptiche sono visualizzati con il colorante vitale 4-Di-2-Asp (Magrassi et al., 1987), che non influenzano la trasmissione sinaptica, alle concentrazioni e dei tempi impiegati (5 mM, a 5 minuti di trattamento, Cooper et al ., 1995b). Con la microscopia a fluorescenza, il lume di una macro-patch elettrodo di registrazione (Cooper et al, 1995c;.. St ¨ hmer et al, 1983) potrebbe essere posto direttamente su un singolo isolato varici. Per evocare il terminale del nervo, il nervo motore eccitatorio è stimolata come detto sopra. Quantali risposte spontanee e evocati possono essere registrate lungo la stringa di varicosità visualizzati, da dolci abbassando e alzando il lume sopra ogni varici.

I potenziali sinaptici sono registrati tramite una macro-patch elettrodo essenzialmente come descritto da Dudel, 1981; Wojtowicz et al. (1991) e Mallart (1993). Kimax vetro (diametro esterno: 1,5 mm) è stato tirato e il fuoco-lucido per la produzione di punte di patch con diametro interno da 10 a 20 micron. Il lume del l'elettrodo viene riempito con il mezzo bagno. L'amplificatore è la stessa di quella utilizzata per le registrazioni intracellulari di cui sopra. Elettrodi e la resistenza di tenuta può essere determinato facendo passare impulsi di corrente di prova attraverso l'elettrodo. Resistenze sigillo variava 0,3-1,0 M0hm e la resistenza elettrodo variava 0,5-1,0 m.0. Resistenza sigillo può essere monitorato per tutta la registrazione.

Conteggio diretto degli eventi quantali è possibile con basse frequenze di stimolazione. Per ogni risposta evocata, il numero di eventi quantali può essere determinato. Per una serie di risposte, il numero totale di eventi quantali vengono contati per stimare quindi significare contenuto quantal basata su questi conteggi diretti. Un approccio per calcolare la media dei contenuti quantal sta prendendo il numero totale di quanti e dividere per il numero totale di risposte (del Castillo e Katz, 1954). Ci sono altri approcci si può usare anche in base alla ampiezza di picco o l'area del EPSPS (Cooper et al. 1995b).

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Vedi storici e dimostrazione di Fisiologia presso la NMJ del Muscolo Opener gamberi di fiume
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Cooper, A. S., Cooper, R. L. Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle. J. Vis. Exp. (33), e1595, doi:10.3791/1595 (2009).More

Cooper, A. S., Cooper, R. L. Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle. J. Vis. Exp. (33), e1595, doi:10.3791/1595 (2009).

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