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Biology

Ver histórico e demonstração Fisiologia da MNJ da Muscle Opener Crayfish

doi: 10.3791/1595 Published: November 9, 2009

Summary

O músculo da perna opener crustáceo é apresentado por sua importância histórica e versatilidade experimental no fenótipo muscular, fisiologia e plasticidade sináptica.

Abstract

Aqui apresentamos algumas das descobertas chave importante feita com a preparação neuromuscular opener (MNJ) de crustáceos e mostram que ainda há muito a aprender com esta preparação modelo. Na compreensão da história pode-se entender porque até hoje essa MNJ oferece ainda um playground para ricos abordar questões sobre função de pré-e pós-sináptica e plasticidade. A viabilidade e facilidade de acesso ao terminal de eletrofisiologia intracelular, bem como extracelular e de imagem são vantagens significativas. Os mecanismos por trás da modulação da cinética de fusão vesicular e dentro dos terminais de alta e baixa de saída estão implorando para investigação. A preparação também oferece um sistema modelo testável para avaliação computacional e manipulações para examinar as principais variáveis ​​em modelos teóricos da função sináptica, por exemplo, a dinâmica do cálcio durante a curto prazo de facilitação. A complexidade sináptica da zona ativa e da natureza estatística da liberação quântica também é uma área aberta para futuras investigações tanto experimentalmente e computacionalmente.

Protocol

Introdução

As junções neuromusculares de crustáceos têm fornecido importantes contribuições para a fisiologia e particularmente à fisiologia sináptica ao longo dos anos. A facilidade de dissecção e viabilidade são provavelmente os principais fatores que promoveram fisiologista anatomista e depois começo a usar crustáceos como preparações experimental. Lagostas em particular, são facilmente obtidos a partir de fluxos de água doce mais e lagos, assim como eles são fáceis de manter em um ambiente de laboratório, em comparação com os crustáceos exigindo um resfriado, o ambiente de água salgada.

Um zoólogo de volta no final de 1800 levou ao coração de determinadas espécies de crustáceos (ie, lagostas) e escreveu um livro intitulado A lagosta ( TH Huxley , 1879). Este texto serviu como livro-guia sobre estes organismos por anos e hoje ainda é saudada como um livro abrangente sobre seletivamente lagostins lidando com história de vida, anatomia e fisiologia. Huxley viu o crustáceo como um modelo animal para mergulhar nas profundezas da zoologia em todos os aspectos, assim, o carácter abrangente do seu livro. O timing foi vantajosa, fisiologia estava florescendo no final de 1880 com a compreensão de Ringer de íons necessários para manter as preparações do coração de rã (Ringer, 1882a, b). Esta é provavelmente uma das razões que experimentos fisiológicos progrediu rapidamente em outras espécies, bem como a lagosta. Além disso, uma solução salina para manter a preparações de crustáceos tinha sido descrito por van Harreveld em 1936.

Surpreendentemente, a inervação do músculo abertura nas pernas lagostas também estava sendo caracterizado por volta dessa época na história (Biedermann, 1887). Mas ainda mais surpreendente é que os estudos fisiológicos já estavam em andamento nos músculos do crustáceo por Charles Richet, na França. Na verdade, as experiências em lagostas podem, eventualmente, ser o primeiro a demonstrar a facilitação na neuromuscular (MNJ) (Richet, 1879; ver também Richet, 1881). Sobre as próximas décadas NMJs lagostas estavam sendo descritos anatômica e fisiologicamente em relação ao desenvolvimento de tensão e anatomia (Van Harreveld e Wiersma, 1936).

O advento da gravação intracelular, com eletrodos pontiagudos (Ling e Gerard, 1949), revitalizou a campo para enfrentar diferentes conjuntos de questões. Músculos crustáceo foram conhecidos para produzir contrações classificados (Katz & Kuffler 1946; Katz, 1949; Wiersma, 1949), mas não foi até 1953 que Fatt e Katz registrados potenciais transmembrana da facilitação de curta duração em fibras musculares de caranguejo.

O músculo opener nos membros de crustáceo foi novamente destaque em 1961, quando Dudel e facilitação Kuffler demonstrado neste músculo e mostrou para a 1 ª vez o fenômeno da inibição pré-sináptica (1961a, b; Dudel, 1963, 1965a). Eles também relataram sobre a natureza quântica da transmissão sináptica neste MNJ (1961b). Nos últimos 50 anos tem havido um pouco de atenção dada à preparação e várias técnicas usadas para monitorar a fisiologia sináptica. Para uma breve sobre vista de investigações com esta preparação, começamos com a notar que o músculo inteiro é inervado por um excitatórios e inibitórios um axônio que pode ser seletivamente estimuladas. Atwood (1964) demonstraram com os trens de estimulação pós-sináptica excitatória os potenciais facilitado e produziu a tensão muscular. Iravani (1965) relataram diferenças regionais nas respostas sináptica, dependendo da região do músculo. Logo depois Dudel (1965a, b) registraram potenciais ao longo do terminações nervosas na abertura e demonstraram que a serotonina neuromodulador transmissão sináptica melhorada através do aumento significa conteúdo quântica.

Por esta altura foi estabelecido que os músculos crustáceo responderam ao glutamato e vários aminoácidos, bem como GABA (Van Harreveld e Mendelson, 1959; Robbins, 1959;. Kerkut et al, 1965). As respostas inibitório do GABA foi identificado por Florey (Bazemore et al., 1956, 1957) e outros (Boistel e Fatt, 1958). Mais tarde GABA foi isolado e confirmado por Kravtiz (Kravitz e Potter, 1965; Kravitz et al, 1963a, b;. Kravitz, 1962) a partir dos axônios dos preparativos de abertura de lagosta.

Os músculos lagostas oferecido não só preparações de fácil acesso, mas permite que uma única para estudar como os neurônios motores identificáveis ​​pode resultar em várias respostas pós-sináptico em um nível fisiológico e estrutural. Em particular o músculo opener é inervado por um único neurônio motor excitatórios, mas os potenciais excitatórios pós-sinápticos (EPSPs), em locais diferentes pode variar mais de 50 vezes na dorsal fibras superficiais (Bittner, 1968a, b) e até 8 vezes no superficial ventral fibras (Iravani, 1965).

"> Com o seminal descobrir que o MNJ opener em lagostas exibiu a longo prazo de facilitação (LTF) (Sherman e Atwood, 1971), além de curto prazo de facilitação, a base mecânica para estes fenômenos precisavam ser abordadas. Como um lado nota, potenciação de longa duração (LTP) foi descoberto no cérebro de vertebrados dois anos mais tarde (Bliss e L mo, 1973) sem citação para a descoberta original do fenômeno no MNJ lagostim. A partir deste período os investigadores que estudam a atributos do STF e LTF usando o MNJ abridor de lagostas para estudar os mecanismos celulares (Atwood, 1973, 1976, 1982; Atwood et al, 1994;. Zucker, 1973, 1974a, b; Bittner e Sewell, 1976;. Parnas et al, 1982a, b, c, d; Dudel et al, 1983;.. Vyshedskiy e Lin, 1997a, b, c) Além disso, um ponto de foco tem sido o de entender como um único neurônio motor inerva várias fibras dos músculos no músculo opener pode dar origem a tal variadas respostas sinápticas (Linder, 1974; G · nzel et al, 1993;. Govind et al, 1994;. Iravani, 1965; Atwood, 1967; Bittner, 1968a, b; Sherman e Atwood, 1972; Zucker, 1974a; Parnas et al, 1982a;. Zucker e Haydon, 1988; Dudel, 1989a, b, c, d).

Synaptic estrutura para dar conta do diferencial de respostas sinápticas pode ser investigada através de análise ultra-estrutural (Jahromi e Atwood, 1974). Medidas de diferenças iônicas devido à atividade é capaz de ser investigado com injeções axonal de Ca2 + e Na + indicadores, bem como Ca2 + buffers (Mulkey e Zucker, 1993;. Winslow et al, 2002), e esses fluxos podem ser modelados dentro do terminal (Winslow et al, 1994;. Cooper et al, 1996b).. Adaptações atividade dependente (Atwood et al, 1991.) Ea identificação de subtipos de receptores farmacológicos neuromodulador (Dropic et al, 2005;. Ruffner et al, 1999;. Sparks e Cooper, 2004; Sparks et al, 2004;. Tabor e Cooper , 2002;) que influenciam piscinas das vesículas sinápticas e de cinética (Logsdon et al, 2005;. Southard et al, 2000;.. Sparks et al, 2003) também foi examinada, que está liderando o caminho a novas questões a serem abordadas. Os conceitos de papel de cálcio durante STF contra a despolarização da membrana na transmissão sináptica no MNJ opener levar a algumas diferenças de opinião (Mulkey e Zucker, 1991; Hochner et al, 1989).

Há relativamente pouco tempo a diferenciação regional na força sináptica e facilitação do único neurônio motor, foi abordada e parece ser devido a diferenças de locais pré-sináptico mudanças na estrutura e fisiologia sináptica (Atwood et al, 1994;. Atwood e Cooper, 1995, 1996a , b; Cooper et al, 1995b, 1996a, b).. Análise ultra-estrutural de elétron micrográfica de estudos tem mostrado que a varicosidades conter a maioria dos contatos sinápticos (Florey e Cahill, 1982;. Cooper et al, 1995b). A força da transmissão sináptica diminui ao longo do comprimento de um único terminal que parece ser devido à complexidade da estrutura sináptica (Cooper et al, 1996a;.. Govind et al, 1994). As diferenças na estrutura sináptica pode em parte explicar as diferenças na Ca2 + fluxo durante a estimulação em várias freqüências (Cooper et al., 1995b, 1996b).

Uma vez que existem diferenças regionais no fenótipo muscular e da bioquímica, entre as fibras musculares do abridor (G ° nzel, et al, 1993;.. Mykles et al, 2002), que são divididos em regiões, poderia explicar um fenótipo muscular developmentally regulamentado que influências e mantém as diferenças regionais do neurônio motor (Mykles et al., 2002). A idéia retrógrada de influências tem sido investigado no músculo esquelético de rã (Nudell e Grinnell, 1983), na lagosta (Katz et al., 1993), e em lagostas (Lnenicka e Mellon, 1983) com evidências convincentes razoável. A regulamentação local de terminais em um único neurônio sem influenciar outros terminais é espacialmente bastante possível em neurônios motores, pois o crustáceo terminais podem medir a partir de 1cm a 10cm de distância um do outro. Ao contrário dos vertebrados, uma unidade de motor pode incluir mais de um músculo em invertebrados (ver revisão por Atwood, 1973). O Excitor neurônio motor que inerva o músculo opener inteira também inerva o músculo maca em um segmento mais proximal da perna. Medidas de facilitação entre as fibras musculares do músculo opener mostrou que há diferenças que podem estar relacionados com os níveis de repouso em Ca2 + íons (Cooper et al., 2005b) e / ou possivelmente cooperativa de liberação (Parnas et al., 1982a, b)

As diferenças na complexidade estrutural entre as sinapses de alta e baixa ao longo de saída nos terminais no músculo opener foram investigadas para assinaturas quântica no que diz respeito ao recrutamento de active zonas entre sinapses durante o STF, mas isso provou ser difícil de determinar (Lancaster et al, 2007;. Viele et al, 2003, 2006).. Possível as piscinas de vesículas entre as sinapses de alta e de baixo débito venha a ser regulados diferencialmente na cinética, como é conhecido neromodulators têm efeitos diferenciais nos terminais de baixa e alta saída (Logsdon et al, 2005;. Sparks e Cooper, 2004; Cooper et al., 2003).

O uso futuro da preparação muscular opener em lagostas é tão rico como tem sido 50 ou 100 anos atrás. A preparação ainda é muito resistente em comparação com muitas outras preparações sináptica. Respostas eletrofisiológicas quântica pode ser gravada diretamente na contatos sinápticos, bem como fotografada para a dinâmica das vesículas em diversos tipos de terminais bem definidas. A preparação não perdeu o seu encanto em ter neurônios único de identificação para as entradas excitatórios e inibitórios. Apesar das lagostas não ser prático para a manipulação genética, os estudos são possíveis de abordar o papel das proteínas sinápticas como para Drosophila. Há muitas semelhanças na função sináptica de Drosophila NMJs (Atwood e Cooper, 1995, 1996a, b) que pode ser examinada por estudos de injeção de proteína (He et al., 1999). O regulamento das piscinas das vesículas sinápticas nos terminais nervosos do motor também é uma área rica para futuras investigações, bem como estudos sobre os mecanismos para compreender a regulação de cálcio durante o STF (Desai-Shah et al, 2008;. Desai-Shah e Cooper, 2009) para explicar muitas dos mistérios remanescentes nos fundamentos da transmissão sináptica.

Métodos

Dissecação

Lagostas, Procambarus clarkii, medindo 60-10 cm de comprimento do corpo (Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA) são induzidos a automatizar a perna primeiro ou segundo andar por força beliscar no segmento ischiopodite.

Figura 1
Vire a perna ao redor até que se pode ter certeza fora (lateral) é voltada para cima na placa de dissecção. Este é geralmente o lado arqueado para cima. Colocando a perna em um pedaço de lenço de papel ajuda para a preparação pode ser transformada com facilidade ao fazer esses cortes.

Figura 2

Com um disjuntor de lâmina de bisturi e detentor de uma lâmina afiada é usada para a cutícula etch até pouco cortando no padrão mostrado nesta figura para o segmento meropodite. Cuidado deve ser usado para não cortar para longe distal na dorsal para cortar ventral pela meropodite - carpopodite conjunta. Deixe a cutícula no lugar por agora.

Figura 3

Figura 4

Com a lâmina de barbear bisturi etch a cutícula na propodite até pouco cortando no padrão mostrado na figura acima para o segmento propodite de um lado e repita do outro lado juntar os cortes proximal. Cuidado deve ser usado para não cortar o músculo abridor. Isto pode ser feito mantendo a lâmina inclinando-se para mais perto do músculo durante o corte através da cutícula. Também para o dorsal para cortar ventral, ligando todo o lado ventral, ter cuidado para não cortar demais proximal como a ligação conjunta é estreito e facilmente quebrado. Deixe a cutícula no lugar por agora.

Figura 5

Os preparativos devem ser colocados em solução salina. Este prato deve ter uma dissecção Sylgard revestimento (Dow Corning) na parte inferior (1cm de espessura). Sylgard A é usado para que os pinos de insetos pode ser preso a ele para segurar a preparação ainda. Neste ponto colocar um pino no canto dorsal caudal, dentro da corte, da janela feita no meropodite.
Com uma pinça fina (# 5) levantar um pouco a cutícula da extremidade distal e com a navalha, corte as fibras do músculo flexor longe de cutícula, cortar em um distal para proximal maneira. Levante a janela de fora cutícula.

Figura 6

Figura 7

Agora corte a apodeme (tendão) no meropodite - carpopodite conjunta (mostrado abaixo). Tenha muito cuidado para puxar o tendão longe da cavidade perna antes de fazer o corte e só cortar o tendão e não o nervo da perna principal que está na parte interna do tendão. Aperte o tendão onde foi cortado com uma pinça e puxe o músculo flexor off, levantando-o em uma direção caudal. Agora o nervo da perna principal eo músculo extensor estão expostos.

Figura 8

Proceder ao segmento propodite e agora cortado no dactylop propoditeodite conjunta. Aqui o mais perto do tendão talvez cortado da penhora cutícula. Puxe o segmento (lado mais próximo do músculo) ventral do propodite baixo e para trás caudalmente, de modo que o músculo anexado na região caudal pode ser visto. Cortar esses músculos com a navalha. Tenha cuidado para não cortar o músculo muito próximo à articulação e risco cortando o ramo do nervo motor para o músculo abridor. O músculo opener é agora exposta ao soro fisiológico.

Figura 9

Figura 10

Retornar à região para isolar o meropodite feixes de nervos que contém os neurônios motores excitatórios e inibitórios para o músculo abridor. Na região mais caudal do segmento meropodite o feixe de nervos da perna geralmente contém um feixe de nervos separados. Esta pequena região onde dois feixes pode ser visto é o lugar onde o feixe dorsal pode ser seccionado com uma tesoura bem. O corte final pode ser pego com uma pinça # 5 e gentilmente puxou distalmente até cerca de metade do comprimento do segmento meropodite é atingido. Este ramo do nervo longo contém o nervo opener excitatórios e quanto maior o feixe de nervos contém o neurônio motor inibitório do músculo abridor.

Figura 11

Figura 12

Figura 13

A preparação no segmento meropodite agora é cortar de uma forma diagonal tal que um pino de insetos podem ser colocadas através do aspecto dorsal do meropodite. Isto posiciona o aspecto ventral do músculo abridor de modo que ela enfrenta o observador (como mostrado abaixo).

Figura 14

Figura 15

Figura 16

As fibras residuais do próximo muscular que bloqueia a visão do músculo opener pode agora ser removido, empurrando as fibras contra a cutícula e para fora da cavidade propodite. Às vezes, um tecido conjuntivo que cobre a abertura pode ser removido com cuidado usando o # 5 pinças. O nervo da perna principal que corre ao longo do músculo opener e vai para o dactylopodite pode ser cortada no início da articulação dactylopodite ou simplesmente puxado para cima com a pinça fina. Este nervo da perna principal e, por vezes, o vaso sanguíneo óbvios associados podem agora ser puxado delicadamente em um sentido proximal para o comprimento do músculo opener e depois cortar.

Figura 18

Agora o músculo opener é exposta sem qualquer tecido para ficar no caminho de um eletrodo intracelular ou um eletrodo macropatch focal.

Figura 19

, A fim de estimular o nervo para o músculo excitatórios opener a preparação está agora mudou-se para uma câmara de gravação projetado com um eletrodo de sucção de plástico. Tendo o eletrodo estimulando construída na câmara evita ter que usar um micromanipulador para colocar um eletrodo estimulante. Pin a preparação para baixo no prato de gravação e coloque o ramo do nervo que contém os nervos excitatórios no eletrodo de sucção.

Figura 20

Figura 21

(Tirado de: Mykles, DL, Medler, SA, Koenders, A., e Cooper, RL (2002) de proteína miofibrilar expressão isoforma está correlacionada com a eficácia sináptica em fibras lentas da garra e músculos da perna abridor de lagostim e lagosta Journal of. Experimental Biology 205 (4): 513-522).

Salina

Preparações dissecados são mantidos em solução salina lagostas, uma solução modificada Van Harreveld (em mM: NaCl 205; 5,3 KCl, 13,5 CaCl2.2H2O; 2,45 MgCl2.6H2O; 5 HEPES pH ajustado para 7,4).

Gravação EPSPs intracelular

De obter uma resposta evocada, o axônio excitatório é seletivamente estimulados por um estimulador Grass. A região do músculo opener é empalado com eletrodo intracelular afiado (20-30 resistência mOhm) cheia com 3 M KCl. A fase de cabeça padrão e amplificador para a gravação intracelular pode ser usada, no entanto usamos um modelo Axonclamp 2B (dispositivos Molecular, Sunnyvale, CA, EUA), amplificador e um estágio de X cabeça LU. Facilitação de curto prazo (STF) ou outro tipo de respostas diversas desejado pode ser obtido pela variação das condições de estímulo. STF é obtido, dando um comboio de 10 ou 20 pulsos em 10 ou 20 segundos de intervalo, respectivamente, para o nervo excitatório. A freqüência de estimulação dentro do trem pode ser variado (40, 60 e 80 Hz). Intrgravações EPSP acelular são rotineiramente realizados por estes procedimentos standard (Crider & Cooper, 1999, 2000;. Cooper et al, 1995b; Dudel, 1983; Sparks e Cooper, 2004; Desai-Shah e Cooper, 2009).

O músculo opener é dividido em três regiões geral: distal, central e proximal. Mesmo que o músculo inteiro aberto é inervado por um único neurônio motor, o NMJs são estruturalmente diferentes e as diferenças regionais específicas em termos de eficácia sináptica nessas três regiões geral (Cooper et al. 1995a, b). O músculo fenótipo tipo de fibra também foi mostrado para ser diferente nessas regiões (Mykles et al. 2002). Por estas razões, as fibras mais distais são usados, já que são facilmente demarcados para a consistência entre as preparações.

Figura 22

Gravação focal EPSPs quantal diretamente sobre regiões identificáveis ​​do terminal nervoso

O varicosidades sinápticas são visualizados com o corante vital 4-Di-2-Asp (Magrassi et al., 1987), que não afeta a transmissão sináptica, nas concentrações e tempos de empregados (5 M, 5 min de tratamento, Cooper et al ., 1995b). Com microscopia de fluorescência, a luz de um eletrodo de registro macro-patch (Cooper et al, 1995c;.. St ¨ hmer et al, 1983) poderia ser colocado diretamente sobre uma Varicosidade isolado. Para evocar o terminal do nervo, o nervo motor é estimulado excitatórios como mencionado acima. Espontânea, assim como as respostas evocadas quântica podem ser gravados ao longo da cadeia de varicosidades visualizado, delicadamente abaixar a luz e elevá-la sobre cada varicosidades.

Os potenciais sinápticos são registrados através de um eletrodo de macro-patch essencialmente como descrito por Dudel, 1981; Wojtowicz et al. (1991) e Mallart (1993). Kimax de vidro (diâmetro externo: 1,5 mm) foi puxado e fogo-polido para produzir dicas patch com diâmetros que variam dentro de 1-20 mM. O lúmen do eletrodo é preenchido com o meio de banho. O amplificador é o mesmo que o usado para as gravações intracelular mencionados acima. Eletrodo ea resistência selo pode ser determinada passando impulsos de teste de corrente através do eletrodo. Resistências selo variou 0,3-1,0 M0hm ea resistência do eletrodo variou 0,5-1,0 M.0. Resistência selo pode ser monitorada durante a gravação.

Contagem direta de eventos quântica é possível com freqüências de estimulação baixa. Para cada resposta evocada, o número de eventos quântica pode ser determinada. Para uma série de respostas, o número total de eventos quânticos são contados para então estimar o teor de quantal significa baseada nessas contagens directas. Uma abordagem para calcular teor médio de quantal está levando o número total de quanta e dividir pelo número total de respostas (del Castillo e Katz, 1954). Há outras abordagens pode-se usar também com base na amplitude de pico ou a área da EPSPs (Cooper et al., 1995b).

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Ver histórico e demonstração Fisiologia da MNJ da Muscle Opener Crayfish
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Cooper, A. S., Cooper, R. L. Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle. J. Vis. Exp. (33), e1595, doi:10.3791/1595 (2009).More

Cooper, A. S., Cooper, R. L. Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle. J. Vis. Exp. (33), e1595, doi:10.3791/1595 (2009).

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